《Virology Journal》：Antibacterial potential of five phages in controlling Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium
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背景：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）与屎肠球菌（Enterococcus faecium）是机会性致病菌，因其天然及获得性抗菌药物耐药性（AMR）已成为院内感染的重要威胁。尽管噬菌体治疗因应对日益严重的AMR而受到全球关注，但肠球菌作为
背景：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）与屎肠球菌（Enterococcus faecium）是机会性致病菌，因其天然及获得性抗菌药物耐药性（AMR）已成为院内感染的重要威胁。尽管噬菌体治疗因应对日益严重的AMR而受到全球关注，但肠球菌作为噬菌体治疗靶点的研究仍较匮乏。本研究旨在从医院污水中分离肠球菌特异性噬菌体，评估其单独或组成鸡尾酒配方后的体外感染效力，并考察其与抗生素、人血清共存时对细菌生物膜的清除能力。结果：研究人员分离到1株屎肠球菌噬菌体fHoEfm07（不属于已知任何噬菌体属）及4株粪肠球菌噬菌体——属于Saphexavirus属的fHoEfa01与fHoEfa06，以及属于Efquatrovirus属的fHoEfa03与fHoEfa04。基于基因组特征，Saphexavirus属噬菌体与fHoEfm07适宜用于治疗应用，而Efquatrovirus属噬菌体含潜在AMR相关基因。体外实验表明噬菌体、抗生素与人血清三者间相互作用依赖于特定噬菌体—宿主配对关系或抗生素浓度；此外仅fHoEfa03在作用3 h与24 h后显著降低生物膜量。结论：本研究为模拟噬菌体治疗条件下肠球菌噬菌体的应用潜力提供了有价值见解，新型噬菌体的表征、治疗适用性评估及协同治疗策略探索为推进噬菌体治疗奠定了基础知识。
论文解读：五种肠球菌噬菌体对粪肠球菌与屎肠球菌的体外抑菌及抗生物膜活性评价
研究背景与意义
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）与屎肠球菌（Enterococcus faecium）是临床重要的革兰阳性机会性致病菌，常引起导管相关性尿路感染、血流感染及心内膜炎等院内感染。二者具备天然及获得性抗菌药物耐药（Antimicrobial Resistance, AMR）机制，尤其耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus, VRE）的出现极大限制了抗菌治疗选择。噬菌体治疗是应对AMR感染的潜在替代策略，但肠球菌噬菌体相较于ESKAPEE（肠杆菌科、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等）中其他成员研究尚不充分。本研究自芬兰赫尔辛基和新地医院区（Hospital District of Helsinki and Uusimaa, HUS）医院污水中分离肠球菌特异性噬菌体，系统开展形态学、基因组学、宿主谱、鸡尾酒配伍、噬菌体—抗生素协同、人血清影响及抗生物膜能力评价，以明确其治疗开发前景。该论文发表于《Virology Journal》。
主要关键技术方法
研究人员从芬兰HUS三家医院废水样品中筛获临床分离粪肠球菌与屎肠球菌特异性噬菌体，经噬斑纯化与液体扩增后，采用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察形态；提取噬菌体基因组DNA以Illumina NovaSeq 6000测序，用A5拼接、PhageTerm判定末端及包装方式，Prokka及Phagenomics平台注释开放读码框（Open Reading Frame, ORF），CARD与RAST筛查AMR及毒力基因，ViPTree绘制蛋白质树，MAFFT比对推定受体结合蛋白（Receptor Binding Protein, RBP）/尾部内肽酶；宿主菌全基因组经BV?BR Comprehensive Genome Analysis组装、RAST注释、PubMLST行多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST），PHASTER找原噬菌体，DefenceFinder检限制修饰系统等噬菌体防御机制；采用改良液体生长曲线法（OD600监测）测宿主范围（51株临床肠球菌）、噬菌体鸡尾酒（双/三噬菌体制剂）杀菌效力、fHoEfm07分别与万古霉素（Vancomycin）及达托霉素（Daptomycin）不同浓度的协同作用、正常人血清（Normal Human Serum, NHS）/热灭活血清（Heat-Inactivated Serum, HIS）存在下感染效率，以及结晶紫染色法定量24 h预形成生物膜经噬菌体处理3 h与24 h后的生物膜残余量与浮游菌计数（CFU/ml）。
研究结果
Phages were isolated from sewage water against clinical E. faecalis and E. faecium strains（从污水中分离得到针对临床粪肠球菌与屎肠球菌的噬菌体）
研究人员自医院污水分离到1株屎肠球菌噬菌体fHoEfm07与4株粪肠球菌噬菌体（fHoEfa01、fHoEfa06归为Saphexavirus属；fHoEfa03、fHoEfa04归为Efquatrovirus属）。TEM示均为长尾病毒科（Siphoviridae）形态，fHoEfm07尾最长（~345 nm）且基因组不与已知肠球菌噬菌体聚簇，仅与来源于人类宏基因组的ctQ1G5部分相似。Saphexavirus与Efquatrovirus属噬菌体基因组大小、GC含量、ORF数符合各属特征。fHoEfa01/fHoEfa06与fHoEfa03/fHoEfa04分别共享88.9%与92.4%序列一致性。基因组注释未见溶原性标志与已知毒力因子；fHoEfa03与fHoEfa04携带编码金属依赖性水解酶的推定AMR相关基因，其余三株无已知AMR基因。推定受体结合蛋白（尾部内肽酶，Pfam: PF06605）C端差异提示可能识别不同宿主受体。
Genomic features of bacterial strains used for phage isolation（噬菌体分离宿主菌株的基因组特征）
四株宿主菌经MLST分型分属ST16（两株E. faecalis）、ST81（E. faecalis）与ST2026（E. faecium #5864），均含原噬菌体区、2~10个AMR基因及限制修饰/CRISPR?Cas等噬菌体防御系统，无已知毒素基因。
Proteomics analysis of fHoEfm07（fHoEfm07的蛋白质组学分析）
LC?MS/MS鉴定出fHoEfm07基因组编码的12个蛋白，含9个结构蛋白、2个DNA结合蛋白和1个假定蛋白，支持其分类为新/未充分表征的裂解性长尾噬菌体。
E. faecalis-specific phages were species-specific, unlike the E. faecium phage fHo-Efm07（粪肠球菌特异性噬菌体具种特异性，而屎肠球菌噬菌体fHoEfm07可跨种感染）
用51株临床肠球菌测定宿主范围：4株粪肠球菌噬菌体严格感染E. faecalis（感染率6%~25%），仅fHoEfm07可跨种感染E. faecalis与E. faecium（总感染率6%，含2株E. faecium与1株E. faecalis）。
The phage-phage interactions varied depending on the cocktail composition and target strain（噬菌体间相互作用取决于鸡尾酒组成及靶菌株）
测试所有双噬菌体和三噬菌体组合对共同敏感株的杀菌曲线，发现配伍增效或拮抗高度依赖靶菌株——某些组合（含fHoEfa04/fHoEfa06）较单噬菌体制剂增强清除，另一些组合（fHoEfa03?fHoEfa06）弱于高效单噬菌体，表明鸡尾酒设计不能仅凭属别或数量推断。
fHoEfm07 showed synergistic effects with vancomycin and daptomycin（fHoEfm07与万古霉素及达托霉素显示协同效应）
对达托霉素耐药株#5864与VRE株#5900测试fHoEfm07联合不同浓度抗生素。协同程度具菌株与浓度依赖性：#5864随达托霉素浓度升高协同增强；#5900最高达托霉素浓度(80 μg/ml)协同减弱；fHoEfm07?万古霉素对#5900在最高(200 μg/ml)与最低(5 μg/ml)浓度协同较好，中等浓度(50 μg/ml)最弱。
The phage-host interactions were diverse in the presence of human serum（人血清存在时噬菌体—宿主互作呈多样性）
30%正常成人血清（NHS）或热灭活血清（HIS）存在下，fHoEfa04感染在所有血清浓度下均被促进，fHoEfa03在30% NHS下促进、低浓度略抑，fHoEfa01被抑制，fHoEfa06在30% NHS促进余略抑，fHoEfm07受NHS/HIS影响较小或轻微延迟生长。表明血清效应对肠球菌噬菌体非单一抑制模式，且与特定噬菌体、血清浓度及补体活性相关。
Phages had diverse capacities to reduce preformed biofilms（各噬菌体降解预形成生物膜能力不同）
对24 h预形成E. faecalis生物膜，仅fHoEfa03在3 h与24 h处理后使生物膜量（A595nm）统计学显著下降（p<0.05），其余噬菌体降幅未达显著；浮游菌计数3 h时fHoEfa03与fHoEfm07显著降低。各噬菌体基因组均含一个内溶素（Endolysin）与一个内肽酶（Endopeptidase）基因，无尾部解聚酶，酶差异可能是抗生物膜活性不同的原因。
讨论与结论翻译
讨论指出Saphexavirus属（fHoEfa01、fHoEfa06）与Efquatrovirus属（fHoEfa03、fHoEfa04）均为典型长尾裂解性肠球菌噬菌体，fHoEfm07为与已知分类不符的新型噬菌体并具跨种感染潜能。fHoEfa01、fHoEfa06与fHoEfm07无已知AMR/毒力/溶原基因，初步满足治疗应用前提；fHoEfa03与fHoEfa04所含金属依赖性水解酶功能未明，需进一步安全性评估。窄宿主谱与尾部内肽酶C端变异相关。噬菌体鸡尾酒效果菌株特异性强，抗生素—噬菌体协同样本间异质，人血清影响具噬菌体特异性，仅Efquatrovirus属fHoEfa03具显著抗生物膜活性。
结论（ translated ）：
现有肠球菌噬菌体及其治疗适用性研究仍有限。本研究表明fHoEfa01、fHoEfa06与fHoEfm07因其裂解生命周期及无害基因特征在噬菌体治疗中具应用前景；而fHoEfa03与fHoEfa04基因组中金属依赖性水解酶的临床意义需进一步探究后方可考虑治疗用途，但其抗生物膜活性在医疗及水务基础设施除菌方面具潜在价值。本研究强调噬菌体—噬菌体及噬菌体—宿主互作关系的复杂性，指出推进噬菌体治疗前需积累更多体外与体内实验数据以支持后续计算与自动化表征方法的开发。
