《Apidologie》：Sublethal chronic exposure and lethal acute exposure to indoxacarb-based insecticide cause histopathological and cytopathological changes in the midgut of Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae)
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蜜蜂在生态系统中发挥重要作用，农业受益于其授粉服务。然而，以意大利蜜蜂(Apis mellifera)(膜翅目：蜜蜂科，Hymenoptera: Apidae)为代表的蜂群数量正在下降，杀虫剂是主要促成因素之一。蜜蜂在觅食过程中可能在田间急性接触杀虫剂，或慢性
蜜蜂在生态系统中发挥重要作用，农业受益于其授粉服务。然而，以意大利蜜蜂(Apis mellifera)(膜翅目：蜜蜂科，Hymenoptera: Apidae)为代表的蜂群数量正在下降，杀虫剂是主要促成因素之一。蜜蜂在觅食过程中可能在田间急性接触杀虫剂，或慢性摄入被污染的花蜜和花粉并将其携带回蜂巢。虽然杀虫剂通常靶向特定器官，但非靶标器官如中肠(Midgut)亦可受到影响。茚虫威(indoxacarb)是一种前体杀虫剂(pro-insecticide)，具神经毒性活性，需经酶激活才发挥作用，被认为对许多非靶标生物安全。本研究评估了非洲化A. mellifera工蜂经口急性致死及慢性亚致死剂量暴露于茚虫威类杀虫剂商品制剂对其中肠的影响。研究人员估算了浓度—死亡率曲线，并以3日龄工蜂为对象，采用24 h LC50（半数致死浓度）及LC5/100（近似无作用致死浓度）持续8 d进行组织病理学与细胞病理学分析。两种处理均引起符合中肠损伤特征的改变，包括空泡化(vacuolization)、顶端细胞突起(apical cell protrusions)、细胞脱落(cell elimination)及上皮结构紊乱(epithelial disorganization)。超微结构分析揭示细胞毒性、具自噬形态特征的空泡化、典型囊泡化粗面内质网(vesiculated rough endoplasmic reticulum)及基膜迷路(basal labyrinth)结构紊乱。这些结果首次证明，即便在亚致死浓度下，茚虫威类杀虫剂也可引起蜜蜂肠道组织学及超微结构的改变，符合对蜂群健康的有害损伤。这表明长期接触茚虫威类杀虫剂残留有可能对工蜂乃至整个蜂群造成负面影响。
论文解读：茚虫威类杀虫剂对意大利蜜蜂(Apis mellifera)工蜂中肠的亚致死与急性暴露致组织及细胞病理学损伤
研究背景与立题依据
蜜蜂（尤指Apis mellifera）为全球自然及农业生态系统提供关键授粉服务，但其种群正因种间竞争、气候变化、病原及农药广泛使用而衰退。杀虫剂不仅以致死剂量直接减少野外蜂群，亚致死(sublethal)剂量亦可引发生理、形态及行为改变，最终危及蜂群维持。茚虫威(indoxacarb)属恶二嗪类(oxadiazine)新型神经毒杀性杀虫剂，为需经酯酶或酰胺酶生物活化(bioactivation)的前体杀虫剂(pro-insecticide)，活化产物可阻断昆虫神经元电压门控钠通道(voltage-gated sodium channels)，传统观点认为其对非靶标生物较安全。然而近年证据表明其对非靶标生物存负面影响，且田间可在花粉、蜂粮(beebread)、蜂蜡中检出茚虫威残留。虽其主要靶点为神经系统，经口摄入的杀虫剂首先接触中肠——负责消化、吸收及含再生细胞(regenerative cells)、柱状消化细胞(columnar digestive cells)和内分泌细胞的非靶标器官，已有其他杀虫剂致中肠损伤的报道。鉴于缺乏茚虫威商用制剂对非洲化A. mellifera工蜂中肠（非靶标器官）急/慢性暴露的组织及超微结构毒性病理学研究，本研究就此展开。
研究人员以非洲化A. mellifera工蜂为对象，采用商用茚虫威制剂Avatar? CE开展急/慢性经口毒性实验，测定24 h LC50及LC5/100，通过光学显微镜（组织病理学）及透射电子显微镜(TEM, Transmission Electron Microscopy)观察中肠（尤后肠中段posterior midgut）的形态与超微结构改变，首次证实即便是亚致死残留浓度亦可致中肠显著损伤，提示田间残留具危害蜂群健康的潜在风险。该研究成果发表于《Apidologie》。
主要关键技术方法
研究人员从巴西Vi?osa联邦大学中央蜂场三个健康意大利蜜蜂(Apis mellifera)非洲化蜂群新生出房工蜂(<24 h)中采集试虫，于标准笼养条件下饲喂蜂蜜与花粉至3日龄供试。①浓度—死亡率生物测定：以含梯度茚虫威(a.i. 73.2–2.28 mg/L)的50%(w/v)蔗糖溶液经口暴露，参照OECD No.213用Probit模型估算LC50(24h)及LC5/100。②光镜组织病理：取急(LC50, 24 h)慢(LC5/100, 8 d)暴露组及对照组工蜂中肠，Zamboni固定、Leica组织树脂包埋、H&E染色、Olympus BX-60光镜观察。③透射电镜超微结构：中肠经2.5%戊二醛及1%锇酸双固定、LR White树脂包埋、醋酸铀—柠檬酸铅染色后于Zeiss Libra 120 TEM观察。
研究结果
3.1 Concentration–mortality（浓度—死亡率）
Probit模型拟合良好(p>0.05)，24 h LC50为4.06 mg a.i. L?1，LC5/100为21.8 μg a.i. L?1，对照组死亡率<5%。
3.2 Light microscopy（光学显微镜观察）
对照组中肠单层柱状消化细胞具球形核、发达刷状缘(brush border)及基底再生细胞巢，前后中肠区无差异。急性暴露LC50(24 h)组后肠中段上皮出现胞质空泡化增加、局部上皮结构紊乱、明显顶端突起及带固缩(pyknotic)核的细胞碎片释放入肠腔。慢性暴露LC5/100(8 d)组后肠中段出现广泛空泡化、显著顶端胞质突起伴细胞碎片增多、凋亡细胞（部分核固缩）脱落入腔。两种处理损伤均以 posterior midgut（后肠中段）最显著。
3.3 Transmission electron microscopy（透射电子显微镜观察）
对照组消化细胞顶面具微绒毛(microvilli)、丰富线粒体，核染色质解聚、核仁明显，粗面内质网(rough endoplasmic reticulum, rER)及发育良好的基膜迷路(basal labyrinth)伴厚基底层(basal lamina)。急性LC50暴露组：核周区电子透明囊泡(electron-lucent vesicles)增多，顶端胞质含具自噬形态空泡（自噬体autophagosomes及自噬溶酶体autophagolysosomes）。慢性LC5/100暴露组：顶/核周区rER呈囊泡化(vesiculated rough endoplasmic reticulum)、电子透明囊泡增多，基膜迷路短且稀疏、与血腔(hemocoel)连通受限，部分细胞顶端膜破裂呈坏死性胞质紊乱。
讨论与结论总结
讨论指出本研究所用商用茚虫威制剂LC50(24h)=4.06 mg a.i. L?1，田间已检出蜂巢内茚虫威残留，EFSA将其列为对蜜蜂危险物质。本研究首次揭示急/慢性暴露致A. mellifera中肠（尤后肠中段）组织及超微结构损伤，推测中肠消化细胞顶端溶体非特异酯酶参与茚虫威生物活化，活化产物在吸收量超过解毒能力之区域（后肠中段吸收力强）引发毒性；P450基因上调主要见于头部而非腹部暗示解毒资源倾向保护神经系统。细胞消除、顶端突起及碎片释放可为凋亡(apoptosis)与潜在排毒反应。空泡化、自噬泡、rER囊泡化及基膜迷路紊乱为典型细胞应激/内质网压力(endoplasmic reticulum stress)引发自噬(autophagy)标志，过度自噬可继发坏死(necrosis)与上皮退变。中肠上皮及基膜迷路损伤将干扰消化、营养吸收、免疫及解毒，叠加亚致死农药效应与营养胁迫(nutritional stress)协同风险。所设亚致死浓度(21.8 μg/L)与田间蜂粮、花粉中检出的茚虫威残留量级相当，具生态相关性。超微结构改变可作毒性形态学生物标志物。
结论（翻译）
茚虫威类杀虫剂Avatar? CE的致死性表明该农药可能促使A. mellifera种群衰退，并带来社会、经济及生态后果。在急性和慢性暴露情境下（含具田间相关性的残留浓度），观察到符合中肠组织病理学与细胞病理学损伤的改变。综上，本研究首次揭示了茚虫威类杀虫剂即使在残留浓度下对非靶标器官——蜜蜂中肠的细胞效应，为理解杀虫剂如何影响蜂群提供了新视角。
