《Cell Regeneration》：Olfactory epithelium regeneration and homeostasis: cellular and molecular mechanisms and novel methodological advances
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嗅觉上皮（olfactory epithelium, OE）具有终身神经发生能力，并表现出强大的再生潜能，这一特性由水平基底细胞（horizontal basal cells, HBCs）与球状基底细胞（globose basal cells, GBCs）的功
嗅觉上皮（olfactory epithelium, OE）具有终身神经发生能力，并表现出强大的再生潜能，这一特性由水平基底细胞（horizontal basal cells, HBCs）与球状基底细胞（globose basal cells, GBCs）的功能协同所介导。这些祖细胞的命运受Sox2、p63、Pax6、Ascl1、Neurog1及NeuroD1等关键转录因子，以及Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）、Notch、YAP及炎症相关调控因子等信号通路的精密调控，共同决定谱系定向与损伤诱导的可塑性。Lgr5、Tmem59、Notch1及Chil4等基因构成的广泛动态调控网络，在OE稳态维持与再生中发挥关键作用。近年来，单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）、空间转录组学（spatial transcriptomics）及类器官模型（organoid models）的发展，揭示了此前未被识别的细胞状态、分化路径及细胞间通讯模式。本综述系统总结了支持OE再生的分子与细胞机制，并重点阐述了推动嗅觉上皮再生研究进展的新兴技术，为恢复嗅觉功能的未来策略提供理论依据。
嗅觉上皮稳态维持与再生的机制
嗅觉上皮是一种异质性组织，由三层结构组成：顶端支持层、中间神经元层及基底祖细胞层。顶端层主要由支持细胞（sustentacular, Sus）和微绒毛细胞（microvillar cells, MVCs）构成，中间层包含成熟与未成熟嗅觉感觉神经元（mature and immature olfactory sensory neurons, mOSNs and iOSNs），二者均持续由基底祖细胞群新生；基底层包含两类主要基底细胞——GBCs与HBCs，在不同条件下分别参与OE稳态维持与再生，共同构成OE的干细胞与祖细胞群体。微绒毛细胞是一类定位于OE顶端的非神经元细胞，参与局部化学感知与上皮修复，其分类尚未完全统一：早期研究将IP3R3阳性微绒毛细胞鉴定为表达神经肽Y（NPY）的群体，通过调控祖细胞活性参与上皮稳态与再生；另有研究指出TRPM5阳性嗅觉微绒毛细胞属于簇状细胞家族，在吸入烟曲霉属过敏原时可驱动嗅觉干细胞增殖。上述证据表明，OE中的MVCs具有比既往认知更高的异质性，可能包含功能重叠但非完全相同的多个亚群。支持细胞是维持OE结构与功能的核心支持细胞，兼具上皮与胶质样特征：其上皮特性体现为排列成栅栏状的顶端层，构成分隔鼻腔与感觉神经元区的屏障；胶质样特性表现为紧密包裹嗅觉感觉神经元树突，提供物理与电绝缘作用，该包裹过程常伴随树突侧向迁移，通过改善绝缘与组织感觉输入促进神经元成熟。除结构作用外，Sus细胞通过谷胱甘肽相关通路参与解毒、清除凋亡碎片，并调节胞外离子平衡以维持适宜的气味转导微环境；其亦具有神经调节作用，可对嘌呤能受体与毒蕈碱受体激活产生钙波反应，并在ATP信号调控下参与离子稳态维持。稳态条件下，Sus细胞主要来源于GBCs；损伤后则可通过HBCs、GBCs及多能鲍曼腺细胞等多条途径生成，且是损伤后最早出现的细胞类型之一，有助于快速恢复屏障完整性，为基底细胞增殖与神经元分化创造条件，凸显其在OE稳态与再生中的核心调控作用。近期研究进一步揭示，几丁质酶样蛋白4（chitinase-like protein 4, Chil4，又称Ym2）是调控OE稳态与损伤后再生的关键分子，稳态时主要表达于Sus细胞，与GBC增殖及神经元分化密切相关。Chil4全局敲除模型中可见GBC数量减少、细胞周期阻滞、iOSNs与mOSNs生成受损、Sus细胞数量下降及炎症微环境异常，提示Chil4通过协调GBC的神经发生潜能与炎症调控维持OE稳态，但该表型无法完全排除发育阶段的影响。损伤后，Sus细胞中Chil4表达上调，过表达Chil4可通过增强GBC增殖、加速OSNs与Sus细胞恢复促进再生，该效应与炎症信号密切相关：抗炎治疗可抑制Chil4表达并延缓OE再生，而Chil4过表达可部分逆转此效应。衰老过程中，OE中Chil4表达普遍升高，尤其在Sus细胞与HBCs中显著，同时伴随炎症相关基因上调，提示Chil4可能参与应对年龄相关性神经发生衰退与炎症应激的组织反应。成熟OSNs是负责气味识别的主要感觉神经元，传统观点认为未成熟OSNs仅为神经元更新的过渡前体，但近年研究挑战了这一认知：成熟OSNs大量丢失时，iOSNs可选择性响应气味分子，在嗅球形成功能性突触，并支持气味识别与辨别行为；新证据表明，稳态完整的嗅觉系统中，iOSNs同样贡献于气味引导行为，并非仅发挥损伤后代偿作用。同时，完整OE中的iOSNs不仅存在结构突触连接，还具备向嗅球传递信息的生理功能。综上，mOSNs与iOSNs提供部分不同但互补的气味输入流，前者维持稳定的感觉功能，后者既参与持续的环路更新，也在神经元丢失后提供功能韧性。除感觉功能外，mOSNs与iOSNs构成连续更新系统，由基底祖细胞生成的iOSNs作为中间储备池，分化为mOSNs以补偿自然更新与损伤后神经元丢失，这种新生神经元的持续产生与整合，既维持嗅觉感知，也保障OE的再生能力。OSNs来源于基底细胞，其寿命反过来影响基底细胞活性，下文将系统阐述基底细胞向OSNs的分化过程，以及二者如何协同维持OE稳态与再生。HBCs与GBCs是OE再生的主要驱动者，二者在稳态与损伤后的谱系与调控动态存在显著差异。HBCs是一类相对均质的群体，表达Krt5、Krt14、ΔNp63、ICAM1及Sox2，生理稳态下基本处于静息状态，作为储备干细胞池极少进入细胞周期，该静息状态部分由Notch信号维持：成年HBCs中Notch1对维持休眠至关重要，Notch通路活性可维持ΔNp63表达，从而保留HBC的黏附性扁平形态并抑制其激活；其经典下游效应分子Hes1在HBCs中表达，Notch信号中断时Hes1下调，支持Notch1相关转录程序参与稳态HBC状态维持的观点。近期谱系分析显示，即使稳态下HBCs在群体水平仍保留多能性：少数HBCs可直接转分化为支持细胞，多数则通过中间GBC状态生成OSNs、微绒毛细胞与鲍曼腺细胞，但单个HBC在稳态下通常仅产生单一下游细胞类型，表明HBC群体的多能性主要通过单细胞水平的单能命运选择实现。严重上皮损伤时，支持细胞来源Jagged1丢失导致HBCs中Notch信号中断，ΔNp63表达降低，HBCs从静息状态释放；Notch1的功能并非在再生全程固定不变：HBC激活后，Notch1是向神经元祖细胞与OSN命运高效进展所必需的，HBC特异性敲除Notch1会增加静息比例并损害神经元分化，这反映了Notch信号在再生过程中的时序性功能差异——稳态下维持HBC休眠，损伤后则被招募参与激活HBC向谱系定向的过渡，这种变化可能源于配体可用性、细胞共因子及损伤相关信号环境的改变，进而重塑激活HBC中Notch1的转录输出。损伤后HBCs进入瞬时激活状态，伴随动态基因表达变化，发生对称与不对称分裂，平衡自我更新与分化后代生成，包括支持细胞、微绒毛细胞与GBCs，从而支持后续OSN再生，凸显HBC作为损伤OE主要干细胞来源的核心作用。损伤后再生期存在多种调控因子调节HBC激活与分化：通过S1P/S1PR2信号激活的YAP可促进HBC增殖并助力OE再生；HBCs表面的原发纤毛介导与支持细胞的通讯，其发育期缺失会导致神经发生呈区域特异性降低，提示其在损伤修复中的重要作用；HBCs中Pax6表达对神经元分化至关重要，其缺失会损害严重损伤后的OE再生并减少OSN数量；HBCs在OE损伤后重分布关键蛋白，其中Rac1被鉴定为其分化调控因子，抑制Rac1可减少HBC向感觉神经元分化；Ascl3标记向微绒毛细胞与鲍曼腺定向的祖细胞，其损伤后激活是再生支持细胞、维持OE稳态所必需的。此外，HBCs还为GBCs提供关键神经发生微环境，通过结构与分子支持促进其增殖与分化，间接参与OSN再生与上皮稳态维持；FAK抑制上调的CNTF主要由HBCs与嗅鞘细胞表达，而CNTFRα定位于GBCs，提示HBCs可能通过旁分泌机制间接调控GBC增殖与自我更新。除命运调控与上皮修复作用外，HBCs定位于上皮-间质界面，此处OSN轴突穿过基膜形成束状离开OE进入固有层，早期超微结构研究显示基底细胞与轴突束存在紧密物理关联，提示HBCs可能参与组织该过渡过程，表明HBCs不仅是潜伏的多能干细胞储备，更是OE中活跃的多功能组分。
与之相对，GBCs是位于HBC层上方的一类高度异质、动态的祖细胞群体，依据转录因子表达可分为不同亚型：Sox2、Pax6与Six1等早期标志物标记保留广泛谱系潜能的未分化多能祖细胞；Ascl1标记作为过渡放大细胞（transit-amplifying cells, TACs）的活跃增殖祖细胞，衔接未分化GBCs与谱系限制性更强的前体；Neurog1与NeuroD1表达界定向神经元分化、尤其是OSN谱系定向的晚期祖细胞。成年OE中，Neurog1阳性与NeuroD1阳性细胞常丢失Sox2、Pax6与Six1表达，反映其从多能性向谱系限制性的进展。既往研究表明，Sox2与Pax6在GBCs中发挥拮抗作用：Pax6以促进神经元分化为代价减少祖细胞增殖，最终降低总体神经元产量；Sox2初期抑制神经元命运但增强祖细胞扩增，一旦分化启动则增加神经元产量；二者共表达时可相互平衡，确保再生过程中神经元与非神经元细胞的比例适当。功能上，GBCs是稳态下上皮更新的主要驱动者，持续生成新OSNs以替换凋亡与损伤的神经元，同时少量生成支持细胞等其他类型；严重损伤后其潜能显著扩展，表现出明显的多能与可塑性，不仅能生成OSNs，还可生成支持细胞、微绒毛细胞，甚至补充HBC储备，GBC移植实验已证实该特性。此外，损伤后可观察到已部分定向的祖细胞（如Neurog1阳性或Ascl1阳性细胞）发生去分化与重编程，这些神经元定向祖细胞可重新表达Sox2、Pax6与Klf4等多能相关因子，恢复多能性并生成神经元以外的多种OE细胞类型，该过程依赖Sox2启动，并可通过抑制表观遗传调控因子Ezh2增强效率，这种去分化驱动的可塑性进一步凸显GBC区室在OE再生中的适应性。
炎症信号构成情境依赖性调控微环境，对OE内多种细胞的状态与命运决策产生深远影响，其作用具有双重性，取决于持续时间与强度。急性炎症在 epithelial 损伤后迅速发生，是一种瞬时有益反应：通过招募巨噬细胞等免疫细胞并释放促炎细胞因子，激活NF-κB信号，提供刺激HBCs增殖与启动神经元分化的信号。相反，慢性炎症（如慢性鼻-鼻窦炎中长期存在的炎症状态）会破坏OE再生：持续炎症信号改变HBCs功能状态，使其从神经元分化转向免疫防御，伴随趋化因子生成增加与干性相关转录程序改变，最终导致神经发生受损与嗅觉功能障碍。慢性炎症对其他组织再生的有害效应也有报道：骨骼肌中持续炎症信号导致干细胞功能障碍与再生衰退；慢性皮肤创面中促炎细胞因子长期升高阻碍炎症向组织修复过渡；造血系统中持续炎症暴露改变干细胞命运，损害长期再生能力。跨组织研究反复显示，TNF-α、IL-1β、IL-6及CCL2/CCR2等炎症介质与趋化因子通路是再生受损的关键调控因子，提示慢性炎症可能通过部分共享的分子机制损害组织修复，但具体下游结果仍具组织依赖性。值得注意的是，上述发现多来自基因工程慢性炎症模型，虽提供重要机制见解，但可能无法完全模拟体内炎症的复杂生理特性。综上，成功的OE再生依赖于精确调控的炎症反应，而持续或过度的炎症信号会损害神经发生与嗅觉功能。近期研究进一步表明，Th17来源的IL-17A是衰老过程中重塑OE干细胞微环境的关键慢性炎症信号，可抑制神经元再生并促进呼吸上皮化生。
鉴于HBCs与GBCs在OE再生中的多样作用，核心问题在于分子信号网络如何调控基底干细胞/祖细胞的命运决策（包括增殖、分化与去分化），以保障协调的组织更新。其中，Wnt信号是调控两类基底细胞群体的关键通路：在GBCs中，通过Lgr5阳性细胞发挥作用的Wnt/β-catenin信号促进损伤后增殖与多谱系分化；在HBCs中，近期证据表明经典Wnt信号存在内在活性，其激活足以驱动静息状态向活化神经发生状态转变，因此Lgr5是理解Wnt相关调控网络如何在OE再生中塑造基底祖细胞行为的重要切入点。
Lgr5与Wnt信号通路
作为经典Wnt信号靶基因，Lgr5在Wnt通路调控中发挥核心作用。Lgr5及其同源物Lgr4、Lgr6作为分泌型生长因子Rspo1–4的高亲和力共受体，同时结合跨膜E3泛素连接酶Rnf43与Znrf3。无R-spondins时，Rnf43/Znrf3通过促进Frizzled（Fzd）受体降解抑制Wnt信号：Fzd丢失阻止Wnt通路激活，β-连环蛋白（β-catenin）破坏复合物（Axin、APC、CK1α、GSK3β）保持活性，导致β-catenin持续磷酸化、泛素化并经蛋白酶体降解，阻断其核转位及Wnt靶基因的转录调控。而在R-spondins存在时，Lgr5–Rspo结合抑制Rnf43/Znrf3，阻止Fzd降解，使Fzd在质膜累积，允许Wnt配体结合并激活通路。此时β-catenin破坏复合物失活，β-catenin稳定并转位至细胞核，激活Wnt靶基因转录；由于Lgr5本身是Wnt靶基因，这构成放大信号的的正反馈环路。在OE再生背景下，该信号框架尤为重要，因为它将表达Lgr5的基底祖细胞与损伤后调控干细胞激活、增殖及谱系进展的通路联系起来。
Chen等首次在OE中鉴定出Lgr5表达，提示其可能参与基底祖细胞分化与再生；后续研究显示Lgr5的作用随发育与再生情境变化。OE中Lgr5阳性细胞的动态变化已在不同发育阶段得到解析，其丰度、身份与空间分布存在年龄依赖性：Lgr5阳性细胞最早出现于胚胎第16天（E16），数量逐渐增加，在出生后第1–2天（P1–P2）达到峰值，此时主要为有丝分裂活跃的GBCs，且基本局限于基底层；成年后Lgr5阳性细胞数量逐渐下降，稳定在每0.5毫米OE切片约4个的水平。关于Lgr5阳性细胞的谱系归属，Chen等报道其仅局限于GBC谱系，不表达HBC标志物；而Ren等鉴定出部分Lgr5阳性细胞具有HBC特征（表达Krt14与ICAM1），这种差异可能源于方法学区别——基于蛋白的检测方法对低水平表达的敏感性低于RNA原位杂交（如RNAscope）。在新生、成年与衰老阶段，Lgr5阳性细胞的数量、表达模式及在OE稳态与损伤诱导再生中的作用均存在差异。新生OE中，Lgr5阳性细胞是高增殖活性的GBCs，作为神经祖细胞主要贡献未成熟及随后成熟的OSNs生成，维持发育早期的神经元更新，虽部分谱系示踪提示少量后代可分化为支持细胞等其他上皮细胞类型，但其主要功能仍是维持感觉神经元生成，凸显其在建立OE初始细胞结构与功能中的重要性。成年小鼠中，Lgr5阳性细胞在OE稳态与再生中的作用截然不同：稳态下部分Lgr5阳性细胞虽有增殖，但谱系示踪与清除研究表明其对成熟感觉神经元或支持细胞的贡献有限，耗竭Lgr5阳性细胞不改变OE厚度或组成；损伤后，Lgr5阳性细胞被强烈激活，大量增殖并生成包括mOSNs、Sus细胞与鲍曼腺在内的多种OE谱系，再生早期不产生HBCs，但部分Lgr5来源的后代在损伤后约3个月获得HBC标志物并成为静息基底细胞，功能缺失或shRNA敲低Lgr5会损害神经元再生并减少OE厚度，表明成年Lgr5阳性GBCs在稳态下基本非必需，但在再生中是重要的多能祖细胞，并可能最终补充HBC池。衰老过程中，OE中Lgr5阳性细胞功能发生明显改变：损伤老年OE中Lgr5阳性细胞的招募延迟，进入增殖或神经元定向状态的数量较年轻成年个体减少，部分老年Lgr5阳性细胞进入更静息的状态，且较早开始表达HBC标志物，提示其向静息状态偏移，导致老年Lgr5阳性细胞产生的神经元后代显著减少；另一种可能是至少部分细胞发生衰老而非可逆静息，这可能是衰老过程中再生能力下降的原因，但该区分仍需实验验证。
Lgr5
