《GeroScience》：The role of cellular senescence in immune-metabolic features and prognosis of ovarian cancer: an integrated analysis based on single-cell sequencing and multi-omics data
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卵巢癌以高复发率为特征，而铂类耐药常导致患者临床结局不良。细胞衰老能够影响肿瘤微环境、代谢状态及免疫调控。然而，衰老相关基因（senescence-associated genes，SAGs）在卵巢癌异质性、预后及治疗相关特征中的作用，仍有待进一步阐明。本研究
卵巢癌以高复发率为特征，而铂类耐药常导致患者临床结局不良。细胞衰老能够影响肿瘤微环境、代谢状态及免疫调控。然而，衰老相关基因（senescence-associated genes，SAGs）在卵巢癌异质性、预后及治疗相关特征中的作用，仍有待进一步阐明。本研究整合癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）及单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）数据，系统分析SAGs在卵巢癌中的表达模式、单细胞分布、分子亚型，以及其与预后和免疫微环境的关联。研究人员采用一致性聚类（consensus clustering）鉴定衰老相关分子亚型，并构建和验证了SAG相关预后风险模型。进一步评估了风险评分与铂类治疗反应、肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）、免疫细胞浸润及免疫检查点表达之间的关系。SAGs在卵巢癌与正常卵巢组织之间存在差异表达，且主要富集于细胞周期、DNA损伤应答及免疫相关通路。单细胞分析显示，衰老信号主要分布于癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）、恶性细胞及部分免疫细胞群。基于SAG的一致性聚类，患者被划分为3种分子亚型，这些亚型在代谢活性、DNA修复、免疫微环境及基因组稳定性方面存在差异，但亚型间总体生存（overall survival，OS）未见显著差异。一个由8个基因构成的衰老相关风险模型在TCGA队列中显示出预后相关性，且在2个GEO队列中的附加分析支持所筛选SAGs的预后价值。高风险组与更高的TMB、铂类耐药相关特征、更高的免疫评分和基质评分、更低的肿瘤纯度、更低比例的CD8+ T细胞，以及更高表达的调节性T细胞、巨噬细胞和免疫检查点相关，提示其与免疫抑制性肿瘤微环境存在联系。当前研究结果表明，衰老相关分子特征与卵巢癌的生物学异质性、预后分层、铂类反应及免疫微环境状态相关。SAG相关风险模型可为预后评估及未来卵巢癌治疗反应分层研究提供线索，但仍需进一步实验与临床验证。
该研究发表于《GeroScience》，聚焦细胞衰老在卵巢癌中的生物学意义及其与预后、免疫微环境和治疗反应的联系。卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，多数患者确诊时已属晚期，并伴广泛转移，5年生存率仍维持在较低水平。尽管手术联合铂类化疗仍是标准一线治疗，但多数患者最终发生耐药并出现不良转归，因此亟须从分子层面深入理解其进展与耐药机制。细胞衰老传统上被视为肿瘤抑制机制，即细胞进入稳定性细胞周期阻滞状态；然而在肿瘤进化过程中，衰老细胞也可通过衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP，指衰老细胞持续分泌炎症因子与重塑因子）重塑肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），进而参与免疫逃逸与治疗抵抗。既往研究已提示衰老相关基因（SAGs）与卵巢癌化疗耐药有关，但其在卵巢癌不同细胞群中的分布、与TME和分子异质性的关系，以及对临床结局的影响，尚缺乏系统性研究。基于此，研究人员整合TCGA、GTEx、GEO及单细胞RNA测序数据，从群体转录组和单细胞两个层面，系统评估SAGs在卵巢癌中的表达失衡、细胞定位、分子分型价值和预后意义，并进一步分析其与铂类耐药、肿瘤突变负荷、免疫浸润和免疫检查点表达的关系，旨在为风险分层及后续机制研究提供依据。
研究人员主要使用了以下关键技术方法：纳入TCGA/GTEx卵巢癌与正常卵巢组织bulk RNA测序数据、突变数据，以及GEO外部验证队列GSE63885和GSE14764，并采用GSE154600单细胞RNA测序队列（n=5）进行细胞层面分析；通过差异表达分析、蛋白互作网络（PPI）、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析解析SAGs功能；利用Seurat和AUCell评估单细胞衰老信号分布；采用ConsensusClusterPlus进行一致性聚类分型，GSVA和GSEA进行通路比较；再以Cox回归和stepAIC构建8基因预后模型，并结合列线图、ROC、校准曲线及决策曲线分析（DCA）评价临床预测性能。
一、SAGs are broadly dysregulated in ovarian cancer
研究人员基于TCGA-GTEx数据以及CellAge数据库收录的278个SAGs，筛选出135个差异表达SAGs，其中68个上调、67个下调。这些基因的表达谱能够有效区分卵巢癌组织与正常卵巢组织，提示细胞衰老相关分子改变是卵巢癌的重要特征之一。PPI网络分析显示，GAPDH、SRC、CDKN2A、CCND1、CDKN1A和FOS位于网络中心，提示这些基因可能在衰老调控网络中具有枢纽作用。GO和KEGG富集分析表明，差异SAGs主要涉及细胞周期调控、DNA损伤应答、p53信号通路、细胞衰老，以及碳代谢、内分泌耐药、AGE-RAGE信号等通路，说明其不仅与经典衰老程序相关，也可能参与代谢适应与促存活信号调节。进一步的体细胞突变分析发现，32.57%的样本存在SAGs相关突变，TP53、CSMD3、MUC16、TTN和PIK3CA突变频率较高，且错义突变为主。拷贝数变异（copy number variation，CNV）分析提示多数差异基因存在明显扩增或缺失，如GAPDH、CCND1和CDKN2A常见扩增，FOS、SRC、ATM和SIRT1多见缺失，表明基因组结构改变可能推动衰老相关通路在卵巢癌中的异常激活或失调。
二、Single-cell analysis reveals activities of cell-type-specific SAGs in ovarian cancer
为明确衰老信号在卵巢癌不同细胞群中的分布，研究人员对GSE154600单细胞RNA测序数据进行分析，初步划分出30个细胞亚群，并注释为11种主要细胞类型，包括成纤维细胞、恶性细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和浆细胞等。利用AUCell算法，以0.11为阈值将细胞分为衰老信号活跃与沉默两类，共识别3083个衰老信号活跃细胞。结果显示，这些活跃细胞分布于多种细胞类型中，但在成纤维细胞及部分免疫细胞群中比例更高。小提琴图进一步表明，成纤维细胞的衰老AUCell评分最高，恶性细胞次之，单核细胞、巨噬细胞和T细胞等免疫亚群也表现出相对较高的衰老信号活性。该结果说明，卵巢癌中的衰老相关程序并非局限于肿瘤细胞内部，而是广泛涉及癌相关成纤维细胞和特定免疫细胞，提示细胞衰老可能通过多细胞互作参与TME重塑。作者同时指出，由于单细胞样本量较小，这些结果更适合说明相对分布模式，而非进行精确定量比较。
三、SAG-based molecular subtyping reveals biological heterogeneity in ovarian cancer
研究人员进一步评估SAG表达模式能否反映患者间的分子异质性。基于TCGA队列中SAG表达矩阵开展一致性聚类，结合累积分布函数（CDF）曲线及聚类稳定性分析，确定最佳聚类数为3，将患者划分为cluster A、B、C三种分子亚型。主成分分析显示三类亚型在转录组层面具有一定分离度，热图也显示其SAG表达模式和临床特征分布存在差异。尽管Kaplan–Meier生存分析未显示三种亚型间OS有显著差别，但功能层面的差异十分明显。GSVA和GSEA显示，cluster A富集于整合素RhoG/Rac信号、整合素talin/vinculin信号、MHC-I抗原呈递、白细胞介素（interleukin，IL）-2家族/JAK–STAT信号和细胞因子JAK–STAT信号等免疫及微环境相关通路，提示其具有更活跃的免疫-基质互作特征。cluster B主要富集于翻译起始、线粒体电子传递和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）相关通路，提示其偏向代谢重编程与线粒体功能增强。cluster C则呈现较低的免疫相关通路活性，并富集Wnt信号及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）-受体互作等肿瘤相关过程。
TME和基因组稳定性分析进一步支持这一分型框架。cluster A和B的ImmuneScore较高，而cluster A的StromalScore和ESTIMATEScore最高，对应最低的肿瘤纯度，提示其富含免疫和基质成分。cluster C则表现为最高肿瘤纯度、更高的非整倍体评分（aneuploidy score）及更高的基因组改变比例（fraction genome altered），说明其具有更显著的染色体和基因组不稳定性。总体而言，SAG分型揭示了卵巢癌在功能通路、免疫微环境和基因组稳定性上的多层次异质性：cluster A偏向免疫-基质活跃状态，cluster B偏向代谢及DNA损伤应答相关状态，cluster C则更接近肿瘤细胞主导和基因组不稳定状态。尽管该分型并未直接实现生存分层，但为理解卵巢癌中不同衰老相关生物学状态提供了框架。
四、An SAG-based prognostic risk model is associated with survival stratification in ovarian cancer
由于SAG分型对OS分层能力有限，研究人员转而构建连续型风险评分模型以量化预后价值。首先在TCGA队列中通过单因素Cox回归筛选出20个与OS显著相关的候选SAGs，再采用stepAIC方法优化变量组合，最终确定8个关键基因：AAK1、DDB2、ING2、MATK、PMVK、SNAI1、SOX2和WWP1，并据此建立风险评分公式。按照中位数将患者分为高风险组和低风险组后，TCGA队列中低风险组OS显著优于高风险组，中位OS分别为56.6个月和36.7个月。时间依赖ROC分析显示，该模型对1年、3年和5年生存的AUC分别为0.672、0.674和0.711，提示其具有中等以上预测效能。风险评分分布和生存状态图亦表明，高风险患者死亡事件更多、生存时间更短。外部GEO队列GSE14764和GSE63885的验证分析同样显示低风险组预后更佳，支持所选SAGs在不同测序平台中的稳定预后相关性。
五、Integration of the SAG-based risk model with clinical variables improves prognostic prediction
为评估风险评分的独立预后价值，研究人员将其与临床病理变量共同纳入Cox回归分析。结果显示，年龄、种族、新发癌灶以及SAG风险评分为显著预后因素，其中风险评分在多因素模型中仍保持独立预测作用。基于这些因素构建的列线图（nomogram）可预测1年、3年和5年OS。按照总列线图评分分层后，高低风险个体之间OS差异显著，中位OS分别为36.3个月和67.6个月。联合模型的1年、3年和5年AUC分别升至0.699、0.720和0.799，校准曲线显示预测值与实际观察结果一致性良好，DCA则提示在较广阈值概率范围内具有正向净获益。该部分说明，将衰老相关分子特征与临床变量整合，可提升预后评估的稳定性和临床可解释性。
六、The SAG-based risk model is associated with treatment response, mutational features, and the immune microenvironment
研究人员进一步考察该风险模型与治疗反应、突变特征及免疫微环境之间的联系。结果显示，铂类耐药患者的SAG风险评分显著高于铂类敏感患者，提示该模型与化疗反应相关。高风险组还表现出更高的TMB，以及TP53、BRCA1等基因更高的突变频率，部分免疫检查点相关基因如PDCD1、CTLA4的突变频率亦有所增加。GSEA显示，高风险组显著富集于细胞衰老、炎症反应和免疫调控相关通路，包括VEGF–RAGE信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用以及补体/凝血级联等。TME分析表明，高风险组具有更高的ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATE评分，同时肿瘤纯度更低。免疫细胞浸润分析进一步显示，该组调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）和巨噬细胞比例升高，而CD8
+ T细胞比例相对下降；多种免疫检查点如PDCD1和CTLA4表达明显上调。综合这些结果，高风险组对应一种更具免疫抑制特征的TME状态，而非单纯的免疫激活状态，这种状态与较差预后及铂类耐药相一致。
讨论部分总结显示，该研究从多组学角度系统描绘了卵巢癌中的衰老相关分子图谱。差异表达、通路富集、单细胞分布、分子亚型划分以及风险模型分析共同表明，细胞衰老并非孤立事件，而是与DNA损伤应答、代谢重编程、基质重塑、免疫调节及基因组不稳定性共同交织，参与卵巢癌的异质性形成与临床行为塑造。特别是CAFs和特定免疫细胞中的衰老信号增强，提示衰老程序可能通过SASP介导微环境重塑，促进免疫抑制和耐药。作者同时强调，较高免疫浸润并不必然意味着有效抗肿瘤免疫，卵巢癌中可能存在“免疫热”但功能抑制的状态。研究亦指出若干局限性，包括主要依赖公共数据库、相关性分析无法证明因果关系、难以严格区分肿瘤应激诱导衰老与系统性年龄相关衰老、单细胞样本量有限，以及不同公共队列在平台和临床信息上的异质性可能带来残余偏倚。因此，与精准治疗或免疫治疗分层有关的结果目前更适合作为假设生成线索，而非直接临床决策依据。
研究结论部分可译为：本研究围绕衰老相关分子特征，整合分析了卵巢癌的生物学异质性及其与临床结局的关系。研究人员在群体转录组和单细胞水平对衰老相关信号进行了刻画，并鉴定出3种基于SAGs的分子亚型。这些亚型在代谢、免疫微环境和基因组特征方面存在差异；尽管未显示显著的OS分离，但可能反映卵巢癌中不同的衰老相关生物学状态。进一步构建了一个8基因SAG相关风险评分，并与临床变量整合建立了联合预测模型，从而提高了预后分层能力。总体而言，这些发现提示，衰老相关特征与卵巢癌TME重塑、治疗相关特征及预后分层密切相关，可为未来机制验证和治疗反应分层研究提供假设生成性线索。
