《Frontiers in Genetics》：Pathogenic mechanisms of RPGR mutations in X-linked retinitis pigmentosa: integrating clinical pedigree and single-cell transcriptomics
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目的：本研究旨在鉴定一个中国X连锁视网膜色素变性（XLRP）家系中的致病性视网膜色素变性GTP酶调节因子（RPGR）突变，并通过临床数据和单细胞转录组学的整合分析，阐明RPGR相关感光细胞变性的细胞和分子机制。方法：纳入一个三代中国XLRP家系，进行全面的眼科
目的：本研究旨在鉴定一个中国X连锁视网膜色素变性（XLRP）家系中的致病性视网膜色素变性GTP酶调节因子（RPGR）突变，并通过临床数据和单细胞转录组学的整合分析，阐明RPGR相关感光细胞变性的细胞和分子机制。方法：纳入一个三代中国XLRP家系，进行全面的眼科检查，包括最佳矫正视力（BCVA）、光学相干断层扫描（OCT）、眼底自发荧光（FAF）和视网膜电图（ERG）。对先证者进行全外显子组测序以鉴定致病变异，随后通过Sanger测序在家系成员中进行验证。为了分析下游分子机制，研究人员分析了四个发育时间点（D40–D200）的RPGR突变视网膜类器官的公共单细胞RNA测序数据集（SRP535874）。生物信息学分析包括细胞聚类、差异表达分析、基因本体论（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建和伪时间轨迹分析。结果：在先证者中鉴定出RPGR的ORF15区域的一个半合子移码突变（c.2476_2477del; p.R826Gfs*8），并通过Sanger测序在其两个儿子中确认。临床检查显示受累男性视网膜严重变性，女性携带者表现为中间表型，年轻受累男性表现为早期改变。RPGR突变视网膜类器官的单细胞转录组学分析显示，尽管患者失去了外层视网膜结构，但在晚期发育阶段（D150和D200）感光细胞转录活性反常增加，这可能反映了感光细胞前体的异常分化和功能成熟受损。差异表达分析显示应激反应基因上调，光转导和纤毛运输基因下调。GO和KEGG富集分析涉及核糖体生物发生、RNA代谢、泛素介导的蛋白水解和神经退行性疾病通路的紊乱。PPI网络分析表明核心“纤毛运输–光转导轴”的解耦联和协调应激反应模块的激活。伪时间轨迹分析显示感光细胞分化停滞在中间阶段，阻止其进展到功能成熟。结论：研究人员在一个中国XLRP家系中鉴定出一个先前报道但极其罕见的RPGR ORF15移码突变（c.2476_2477del; p.R826Gfs*8）。单细胞转录组学分析表明RPGR功能丧失突变可能破坏纤毛运输–光转导轴，激活应激反应，并阻断感光细胞分化。这些发现扩展了RPGR突变谱，提供了对XLRP发病机制的机制性见解，并对遗传咨询和靶向治疗具有重要意义。
X连锁视网膜色素变性（XLRP）是由RPGR（retinitis pigmentosa GTPase regulator）基因突变引起的最严重视网膜变性疾病亚型之一，约占XLRP病例的70%–80%。RPGR蛋白定位于感光细胞连接纤毛，与RPGRIP1等蛋白形成“门控”复合体，调控蛋白质向感光细胞外节的选择性运输；功能丧失导致外节蛋白运输缺陷和外节更新受损，最终引发感光细胞变性。然而，现有研究主要依赖小鼠模型，由于物种间RPGR序列和功能差异，无法完全再现人类视网膜病理变化，限制了基础研究向临床转化。近年来，人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的视网膜类器官结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，为在人类背景下直接解析RPGR致病机制提供了新途径。本研究基于一个携带RPGR突变（p.R826Gfs*8）的中国XLRP家系，整合临床家系数据和公共scRNA-seq数据集（SRP535874），系统解析该突变诱导的细胞类型特异性和发育动态的下游分子事件，连接单一位点突变与复杂临床表型，为理解XLRP发病机制提供新证据，并为靶向生物标志物和干预策略奠定理论基础。该论文发表在《Frontiers in Genetics》。
本研究主要关键技术方法包括：（1）全外显子组测序（WES）鉴定先证者致病变异，Sanger测序验证家系成员；（2）利用公共scRNA-seq数据集（SRP535874，包含对照和RPGR突变组在D40、D90、D150、D200四个发育时间点的视网膜类器官数据）；（3）生物信息学分析：Cell Ranger处理原始数据，Seurat进行质量控制、归一化、整合（Harmony算法）、聚类和差异表达分析，Monocle 3进行伪时间轨迹分析，clusterProfiler进行GO/KEGG富集分析，STRING数据库和Cytoscape构建PPI网络。样本队列来源为一个三代中国XLRP家系（共6人，包括先证者、女儿和孙子接受全面眼科检查）。
研究结果部分：
3.1 临床和遗传特征（Clinical and genetic profile）：通过全面的眼科检查（BCVA、OCT、FAF、ERG），先证者（I-1）表现为经典严重RP表型：自幼夜盲、进行性视野缩小、BCVA无光感、眼底视盘蜡黄、血管变细、后极部萎缩伴骨细胞样色素沉着、OCT显示外层视网膜结构完全丧失、ERG无响应。其女儿（II-3）表现为女性携带者中间表型：视力下降、OCT显示中心凹轮廓保留但椭圆体带不连续、子视网膜厚度轻度减少、ERG轻至中度响应降低、视野旁中心暗点。其孙子（III-1）表现为早期受累男性：视力下降、眼底周边骨细胞样色素、OCT显示IS/OS连接断裂、外核层轻度变薄、ERG轻至中度振幅降低。这些临床数据展示了不同疾病阶段的表型谱。
3.2 基因检测结果（Genetic testing results）：全外显子组测序在先证者中鉴定出RPGR ORF15区域的半合子移码缺失c.2476_2477del（p.R826Gfs*8），Sanger测序确认该突变在其两个儿子中缺失。该突变位于内在无序的ORF15结构域，导致截短蛋白保留RCC1样结构域但失去C端谷氨酰化底物区域。根据ACMG标准，该变异被归类为可能致病（PVS1，PM2_支持性）。研究还利用IUPred3预测RPGR蛋白内在无序性，确认ORF15区域为长内在无序区域。由于公共数据集（exon14-15缺失）与患者突变（c.2476_2477del）在基因组区域重叠但产生不同截短蛋白，后文机制分析基于公共数据集，需在携带患者特异突变模型中验证。
3.3 单细胞转录组学揭示RPGR突变诱导的视网膜发育异常和分子功能障碍（Single-cell transcriptomics reveals retinal developmental abnormalities and molecular dysfunction induced by RPGR mutation）：对scRNA-seq数据进行无偏聚类和UMAP降维，识别出10个视网膜细胞类型（包括视杆、视锥、OFF双极细胞、双极神经元、视网膜神经节细胞、Müller胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和视网膜祖细胞）。细胞比例堆叠图显示，在晚期发育阶段（D150和D200），RPGR突变组视锥和视杆细胞的转录活性或相对丰度呈增加趋势，与患者OCT显示外层视网膜进行性萎缩形成“转录丰度增加–功能结构丧失”悖论。差异表达分析（DEG）在视锥和视杆细胞中鉴定出大量参与光转导和纤毛运输的基因下调，以及胶质激活和细胞应激相关基因（GFAP、S100A10）上调。点阵图验证GFAP特异表达于Müller胶质细胞，S100A10主要分布于胶质细胞，确认了继发于感光细胞损伤的反应性胶质增生。GO和KEGG富集分析显示，视杆和视锥细胞中DEG均显著富集于“神经退行性疾病通路”（如肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病）和“泛素介导的蛋白水解”通路；视杆细胞还富集于“核糖体生物发生”“rRNA代谢过程”“RNA剪接”；视锥细胞额外富集于“泛素依赖性蛋白分解代谢过程”。伪时间轨迹分析显示，对照组细胞沿伪时间轴（0→30）从早期前体状态连续有序分布至终末成熟状态，而RPGR突变组感光细胞主要集中在中间伪时间范围，达到高伪时间阶段的成熟细胞几乎缺失，表明分化阻滞于中间阶段。PPI网络分析显示，RPGR突变破坏了视杆细胞中的光转导复合体，同时以GFAP和S100A10为关键节点的胶质激活和应激反应模块显著激活，形成一个连接感光细胞功能障碍和胶质激活的协调网络，提示“纤毛运输–光转导轴”解耦联。
讨论总结部分：研究综合临床家系数据和公共单细胞转录组数据集，在单细胞分辨率下阐明了RPGR突变诱导视网膜变性的多层级机制框架。关键发现包括：（1）鉴定出可能致病变异c.2476_2477del，扩展RPGR突变谱；（2）单细胞转录组分析提示RPGR功能丧失突变可能通过破坏“纤毛运输–光转导轴”的动态耦合、激活应激反应、阻断感光细胞分化，导致数量-质量解离（转录活性增加但功能成熟受阻）。研究结论翻译如下：研究人员在一个中国XLRP家系中鉴定出一个先前报道但极其罕见的RPGR ORF15移码突变（c.2476_2477del; p.R826Gfs*8）。单细胞转录组学分析表明RPGR功能丧失突变可能破坏纤毛运输–光转导轴，激活应激反应，并阻断感光细胞分化。这些发现扩展了RPGR突变谱，提供了对XLRP发病机制的机制性见解，并对遗传咨询和靶向治疗具有重要意义。本研究也指出局限性：公共数据库使用外显子14–15大片段缺失模型，与患者特异的c.2476_2477del突变在分子层面可能存在差异；视网膜类器官缺乏血管和免疫细胞等微环境成分，可能影响应激反应和胶质激活的表征。未来需在携带患者特异突变的模型中进行验证。
