《Frontiers in Pharmacology》：Early biomarkers associated with prenatal alcohol exposure and neurodevelopmental outcomes
产前酒精暴露（PAE）是一类重要的生命早期应激源，与持久性的神经发育及神经认知改变密切相关。来自人类研究的累积证据表明，PAE会留下可被检测到的持续分子特征，这些特征存在于胎盘及临床可获取的体液中。本综述总结了近期在胎盘组织、脐带血及外周体液中检测的表观遗传、免疫、内分泌及RNA相关生物标志物的研究进展，及其与神经发育结局的关联。研究人员重点阐述了不同异质性研究设计间的趋同性发现，讨论了当前的方法学挑战与研究缺口，并展望了整合型纵向生物标志物策略的未来方向。综上，所综述的证据支持胎盘及循环生物标志物在早期风险分层中的应用潜力，并可推动对PAE后神经发育改变机制的理解。
1 引言
产前酒精暴露（PAE）是全球范围内可预防的神经发育损伤首要病因之一。酒精可自由通过胎盘，干扰神经发生、神经元迁移、突触形成及髓鞘化等脑发育核心过程，其临床表型涵盖认知、行为及情绪的广泛连续谱，统称为胎儿酒精谱系障碍（FASD）。西方流行病学数据显示FASD影响约1%–5%的儿童，且大量患儿无典型面部畸形特征，导致漏诊率居高不下，其执行功能、注意力、学习、情绪调节及适应行为缺陷常在学龄期或青春期才充分显现。大型队列研究证实PAE与全生命周期不良心理、行为及认知结局相关，即使低至中度暴露也可在新生儿期引发细微但显著的神经行为改变，凸显发育中大脑的脆弱性及单纯依赖早期临床表型识别的局限性。
准确识别PAE是临床与研究的重大障碍。母亲自我报告受回忆偏倚、病耻感及低估暴露程度的影响，而磷脂酰乙醇等胎盘或脐带血客观生物标志物的检出率显著高于问卷法，即便短期新生儿结局未受影响。这一现状揭示了暴露确认、早期生物学改变与迟发神经发育表型之间的关键断层。与此同时，生命早期应激（包括PAE）通过发育编程产生持久脑发育效应的机制受到关注：产前损伤可诱导稳定的分子改变，持续超越暴露窗口并影响长期神经发育轨迹，这与健康与疾病的发育起源（DOHaD）框架相契合。重要的是，这些分子改变可在胎盘及临床可及体液中检测，为识别早期神经发育易感性提供了独特契机。本综述聚焦近期PAE相关胎盘及循环生物标志物与人类神经发育结局的研究，整合表观遗传、免疫、内分泌、血管及RNA领域的证据，旨在总结新兴概念、明确当前缺口，并为生命早期酒精暴露的转化生物标志物策略提供方向。
2 产前酒精暴露相关的早期生物标志物
基于PAE诱导持久生物学改变且神经发育表型随时间逐步显现的证据，研究人员回顾了探索PAE后神经发育结局相关胎盘及循环分子生物标志物的人类研究，旨在识别临床可及组织中可反映早期神经发育易感性的生物学意义特征。纳入研究的特征与主要结果汇总如下。
跨独立人类队列的研究描绘了多层分子图谱，涵盖稳定表观遗传修饰、协调的胎盘转录组与蛋白质组改变、内分泌与免疫信号失调以及循环RNA特征，按生物调控层级与组织来源阐述如下。
2.1 PAE的表观遗传生物标志物
在多层级长期分子编程层面，多项人类研究在胎盘组织及可及外周样本中识别出与PAE相关的基于DNA甲基化（DNAm）的生物标志物，反复涉及调控多能性、神经发育、生长及细胞应激反应的基因。
胎盘全表观基因组关联分析揭示PAE相关的广泛DNAm改变。一项研究在酒精暴露新生儿的胎盘组织中鉴定出689个差异甲基化CpG位点及112个差异甲基化区域（DMRs），以低甲基化为主要特征。DMRs富集于早期发育调控与神经发育相关基因，包括调控多能性与谱系定向的染色质修饰因子DPPA4、对语言与皮层发育至关重要的转录因子FOXP2，以及参与神经内分泌与下丘脑信号通路的TACR3。印记控制区的差异甲基化位点涉及调控胎儿生长与脑发育的H19与IGF2，其DNAm水平与出生体重、头围降低及胎儿脑生长受损替代指标显著相关。时间分析显示，围受孕期酒精暴露与最大幅度的DNAm改变相关。部分胎盘DNAm改变也可在脐带血白细胞及颊黏膜上皮细胞中检测到，其中DPPA4的差异甲基化在不同组织中方向一致，提示部分胎盘表观遗传改变可在临床可及外周组织中追踪。
外周DNAm生物标志物在颊黏膜上皮细胞中被进一步识别。一项研究描述了包含648个CpG位点的DNAm“神经特征”，可在独立队列中稳健区分FASD个体与未暴露对照。差异甲基化CpG位点映射至多巴胺能神经传递（SLC6A3）、免疫调节（HLA-DPB1、HLA-DQA1）、生长与印记（H19）、神经元分化、轴突导向及突触信号通路相关基因，该特征具有高灵敏度与特异度，且与孤独症谱系障碍的DNAm模式不同，支持其对FASD的特异性。
血液DNAm表型特征进一步扩展了上述发现。一项研究鉴定出包含204个CpG位点的DNA甲基化表型特征，可在跨越婴儿期、儿童期、青少年期及成人期的独立队列中准确分类临床确诊的FASD个体。差异甲基化位点包括参与内质网组织的REEP3、RNA剪接调控因子HNRNPF、线粒体功能相关基因SDHAF1、颅面与神经嵴发育转录因子MSC及神经元凋亡相关基因TNFRSF19。该特征的分类性能在不同DNA甲基化芯片平台及独立队列验证中保持稳定。
DNAm改变的功能相关性得到整合分析的支持。全血表达数量性状甲基化（eQTM）分析鉴定出HNRNPF、REEP3、SEC61G、SDHAF1及MSC等位点的顺式调控关系，其DNAm变异与相应基因表达变化相关，并与智力障碍及注意缺陷多动障碍等临床神经发育表型存在关联。
2.2 胎盘转录组与细胞生物标志物
除表观遗传调控外，出生时的胎盘转录组分析识别出酒精相关的基因表达特征及胎盘细胞组成改变，涉及氧转运、血管发育、免疫信号及细胞外基质组织通路。
批量RNA测序分析显示PAE后胎盘基因表达网络协调紊乱。研究鉴定出40个差异表达基因及多个与PAE相关的基因共表达模块，最强关联模块富集于红细胞分化与血红素合成（TRIM58、ALAS2、HBA1、HBA2）、血管生成与缺氧反应（ETS1、KDR、EGLN1）、细胞外基质重塑及中性粒细胞介导的免疫通路。这些转录组改变在围受孕期暴露后最为显著，且需在校正胎盘细胞类型组成后才显现，强调了细胞类型意识分析的重要性。
细胞类型解析的转录组分析进一步揭示胎盘免疫相关改变。研究显示酒精暴露妊娠中胎盘驻留胎儿巨噬细胞（Hofbauer细胞）比例增加。校正细胞组成后，观察到35个炎症相关基因的差异表达，包括参与一氧化氮信号、前列腺素通路、细胞因子与趋化因子调控及神经内分泌信号的NOS2、PTGER3、IL1RN、IL17D、CCR2、XCR1、CRH及LEP。
2.3 内分泌与生长因子生物标志物
胎盘组织、脐带血及外周循环中检测的内分泌与生长因子相关生物标志物与PAE及早产儿神经发育结局相关。
在ENRICH-2前瞻性队列中，胎盘下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴相关生物标志物可预测婴儿神经发育。研究整合胎盘基因表达、蛋白水平及脐带血内分泌指标，分析其与发育结局的关联。编码糖皮质激素受体的NR3C1及编码11β-羟类固醇脱氢酶2型的HSD11B2的表达因PAE状态而异。11β-HSD2蛋白水平及11β-HSD2/11β-HSD1比值（反映胎盘皮质醇灭活能力）也被量化，这些糖皮质激素相关标志物与6–9月龄时贝利婴幼儿发展量表评估的认知、语言及运动综合得分显著相关：更高的HSD11B2表达及11β-HSD2/11β-HSD1比值与更优的发育表现相关。胎盘促肾上腺皮质激素释放激素（pCRH）浓度还与婴儿气质维度（包括定向/调节及消极情感）相关。
脐带血内分泌指标提供了互补信息。出生时检测的皮质醇与皮质酮浓度与胎盘糖皮质激素相关生物标志物相关，并纳入预测婴儿神经发育结局的多变量模型，与认知及运动领域均存在关联。
生长期因子信号改变在外周循环中被识别。一项研究量化了儿童期确诊PAE及FASD儿童的血清胰岛素样生长因子IGF-I与IGF-II水平，两者在暴露儿童中均显著降低。IGF-II水平与全量表智商、工作记忆、加工速度及言语理解等多个神经认知领域显著相关，而IGF-I浓度则与身高、体重及头围等躯体生长参数关联更强，这些关联在校正年龄与性别后仍显著。
2.4 免疫与炎症生物标志物
脐带血、胎盘组织及外周循环中检测的免疫相关生物标志物揭示PAE后先天免疫应答的改变。
一项试点研究显示，中度PAE与脐带血Toll样受体（TLR）活性增强相关。PAE暴露新生儿的脐带血来源外周血单个核细胞（PBMCs）在TLR刺激后表现出增强的细胞因子应答，提示免疫致敏效应可能增加后期神经发育易感性。
幼儿期血浆细胞因子网络分析揭示协调的免疫改变。研究识别出涉及IL-6、TNF-α、C反应蛋白、单核细胞趋化蛋白-4、巨噬细胞衍生趋化因子、巨噬细胞炎症蛋白-1β及胎盘生长因子的免疫互作网络，其在伴神经发育迟缓的酒精暴露儿童中与相对耐受儿童存在差异，这些免疫网络特征与认知发育得分相关。
胎盘免疫改变为上述系统性免疫发现提供了组织层面的对应。酒精暴露胎盘的转录组分析显示炎症相关基因（包括NOS2、PTGER3、IL1RN、CCR2及IL17D）上调，并与胎盘免疫细胞组成改变相关。这些胎盘免疫特征与脐带血及幼儿期血浆中观察到的结构化细胞因子网络改变相平行，支持胎儿-胎盘与外周区室存在协调的免疫失调。
2.5 循环RNA与细胞外囊泡生物标志物
不同发育阶段检测的循环RNA生物标志物提供了PAE相关分子改变的互补信息。一项研究分析了出生后2周及6.5个月婴儿血浆中的循环microRNA，识别出与出生后生长及神经发育结局相关的microRNA表达协同改变。差异表达的microRNA包括参与血管生成、免疫调节、细胞增殖及神经元发育的miR-21-5p、miR-92a-3p、miR-126-3p、miR-146a-5p、miR-328-3p及miR-29a-3p。重要的是，2周龄时的microRNA表达模式与12月龄时的认知表现、婴儿期头围及体重轨迹显著相关，表明产前分子编程可持续至出生后时期。
细胞外囊泡相关RNA生物标志物在妊娠期间提供了胎儿脑源性分子信号的额外特异性。一项研究利用神经元特异性标记物从母体血液中分离胎儿脑源性外泌体，并量化其妊娠期内的microRNA cargo，该方法可选择性评估源自发育中胎儿大脑的细胞外囊泡。酒精暴露妊娠中，这些外泌体内的miR-9与miR-132水平显著降低。这两种microRNA是神经元分化、突触可塑性与活动依赖性基因表达的关键调控因子，其外泌体水平改变与胎儿眼径（早期脑发育替代指标）减小及下游参与神经发生、轴突发育与突触形成的蛋白靶点改变显著相关。
2.6 蛋白质组与血管相关生物标志物
胎盘组织与脐带血的蛋白质组分析识别出酒精相关的血管生成、血管完整性、炎症及屏障相关过程蛋白改变。在胎盘组织中，研究量化了血管与炎症相关蛋白表达，报道酒精暴露妊娠中血管生成相关标志物水平显著降低，包括血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）及膜联蛋白A4（ANXA4），同时VEGFR1（FLT1）与脑海绵状畸形蛋白3（CCM3）表达呈降低趋势。这些蛋白在内皮增殖、血管稳定及微血管组织中发挥关键作用，提示PAE破坏胎盘血管信号与炎症平衡。
脐带血血清的补充蛋白质组分析揭示了酒精暴露新生儿的独特循环蛋白特征。一项研究采用无偏蛋白质组方法识别出载脂蛋白、免疫相关蛋白及血管生成调节因子的水平改变，其中载脂蛋白A-IV（APOA4）在暴露新生儿中显著降低。功能实验显示，人脑微血管内皮细胞暴露于酒精暴露新生儿血清后，内皮通透性增加、细胞迁移受损，伴随紧密连接蛋白与血管生成因子表达降低。这些发现共同提示，PAE相关的循环蛋白质组改变可能反映了与脑发育相关的血管与屏障过程的早期破坏。
3 讨论
本综述整合了近期识别PAE后神经发育改变相关分子生物标志物的人类证据。跨独立队列与异质性研究设计的趋同性发现出现在多个生物层级，包括表观遗传调控、胎盘转录组与蛋白质组特征、内分泌与免疫信号，以及循环RNA与蛋白生物标志物。这些数据共同支持PAE会留下持续且生物学连贯的分子印迹，该印迹可在胎盘及临床可及体液中检测，并与全生命周期的早期神经发育结局相关。
重要的是，此类生物标志物的识别不仅是描述性的，更直接契合识别子宫内酒精暴露儿童神经发育易感性的需求。鉴于PAE常被低估且多数儿童缺乏FASD的典型身体特征，分子生物标志物可提供客观工具，在临床表型完全显现前识别高风险婴儿，这在妊娠期饮酒被低估或被视为低风险的背景下尤为重要。
本综述总结了各生物系统的现有证据，旨在为开发基于生物标志物的策略提供支持，以实现早期风险分层与及时干预。尽管在常规临床应用前仍需进一步验证研究与临床试验，本文综述的数据为推进转化研究、减轻PAE长期神经发育后果提供了结构化框架。
3.1 生物系统间生物标志物信号的趋同性
综述研究的一个核心发现是，生物标志物改变汇聚于调控早期脑发育、生长控制与应激反应的生物通路。表观遗传、转录组与蛋白质组分析反复显示，差异信号涉及发育编程、印记控制、神经内分泌调节及细胞分化相关基因，支持PAE后调控系统的协调破坏。
表观遗传研究一致识别出调控多能性、神经发育转录控制与生长信号的基因差异DNA甲基化。部分甲基化标记的跨组织可检测性提示，胎盘中发生的发育重编程事件在某些情况下可在外周组织中追踪。值得注意的是，许多此类改变映射至神经元分化、突触发育及下丘脑-垂体-肾上腺轴调节通路，强化了其生物学相关性。
胎盘转录组与蛋白质组发现进一步证明血管生成、氧转运与免疫调节相关网络的破坏。胎盘内免疫细胞重塑的证据表明，炎症过程嵌入在PAE后的胎儿-胎盘界面中。这些数据共同将胎盘定位为不仅记录暴露，更是连接PAE与下游神经发育易感性的主动生物界面。
3.2 内分泌与免疫生物标志物作为神经发育的功能相关物
内分泌与免疫生物标志物是最具临床指导意义的发现之一，因其反映了直接参与应激调节与脑成熟的功能系统。胎盘及脐带血中糖皮质激素信号相关标志物的改变指向PAE后下丘脑-垂体-肾上腺轴的失调。这些改变并非孤立的激素变化，而是提示在敏感发育窗口期内胎儿应激反应性的重新校准，对早期认知与行为结局具有下游影响。
从发育视角看，糖皮质激素是神经元成熟与应激回路的关键调节因子。胎盘糖皮质激素调节的破坏可能构成连接PAE与改变应激反应性的共享通路，支持胎盘作为产前应激编程的主动中介而非被动暴露记录的概念。
免疫研究的平行证据进一步支持功能系统层级改变的概念。出生时及幼儿期检测的免疫生物标志物揭示先天免疫应答性改变，而非明显的基线炎症。这种模式与免疫重编程或致敏一致，即刺激后的细胞因子应答被修饰，而不一定升高静息炎症状态。与神经发育迟缓相关的协调细胞因子互作网络的识别表明，PAE后的免疫失调是结构化、基于网络的，而非归因于单一介质。
重要的是，胎盘免疫基因表达改变与外周免疫特征之间的重叠提示，内分泌与免疫通路可能代表更广泛的应激调节轴的相互关联分支。鉴于糖皮质激素信号与免疫激活之间存在公认的双向通讯，这些发现提出了一种可能性：PAE在发育过程中诱导了神经免疫设定点的持久偏移。这种整合失调可能构成连接生命早期酒精暴露与后期认知及情绪障碍易感性的机制桥梁。因此，识别早期炎症生物标志物可能有助于识别高风险个体并支持更早的预防策略。
值得注意的是，PAE新生儿中已报道免疫应答性的性别差异，这表明生物性别可能调节PAE后的早期免疫编程与应激轴调节。在未来的生物标志物研究中纳入性别作为生物变量，可能改善风险分层并增强对不同发育轨迹易感性差异的理解。
3.3 循环RNA与蛋白质组生物标志物：迈向微创检测
RNA与蛋白质组生物标志物代表了临床转化的特别有前景的方向，因其可通过微创采样获取，并可能捕捉神经发育编程的动态层面。出生后不久婴儿血浆中检测的循环microRNA已被证明可预测后期认知表现与生长轨迹，提示产前建立的分子改变在出生后早期仍具有生物学可追溯性。重要的是，microRNA调节参与血管生成、免疫信号与神经元分化的基因表达网络，将其定位为上游调节因子而非损伤的被动标记。
妊娠期母体血液中胎儿脑源性外泌体microRNA的识别进一步强化了RNA生物标志物的转化潜力。由于这些外泌体源自胎儿神经组织，其分子cargo可能比单纯外周标记更直接地反映子宫内神经发育过程。这种方法超越了暴露检测，开始近似于对胎儿神经生物学状态的实时监测，对早期风险分层具有明确的指导意义。
脐带血蛋白质组分析扩展了这一微创框架，识别出与血管完整性、血管生成及内皮功能相关的循环蛋白改变。值得注意的是，功能实验显示暴露于酒精暴露新生儿血清后内皮屏障破坏，提示这些蛋白质组特征可能反映生物学活性的系统性改变，而非偶然的相关。血管发育与血脑屏障成熟对塑造神经微环境至关重要，因此这些发现为外周蛋白改变与中枢神经发育易感性之间提供了机制桥梁。
综上，循环RNA与蛋白质组生物标志物可能捕捉早期生命编程的互补维度：调控维度（microRNA介导的基因控制）、炎症与血管维度（蛋白基信号）及组织特异性维度（外泌体来源的神经网络cargo）。它们在产前与出生后早期的易获取性使其成为纵向监测及整合到多模态生物标志物面板中的极具吸引力的候选者，旨在早期识别PAE后有神经发育损伤风险的儿童。
3.4 方法学挑战与研究缺口
尽管取得了实质性进展，重要的方法学挑战限制了当前识别生物标志物的即时临床转化。各研究样本量普遍较小，且队列在暴露表征、饮酒时间及诊断分类上的异质性引入了变异性，使跨研究直接比较复杂化。如表1所示，研究包含从ENRICH、开普敦出生队列等前瞻性队列到小型临床或病例对照研究的多种设计，酒精暴露模式从产前中度暴露到重度暴露或临床确诊FASD不等。生物样本类型（胎盘、脐带血、颊细胞、血浆）、分析平台（基于阵列的DNAm、RNA测序、靶向蛋白检测）及神经发育结局测量的差异进一步降低了跨研究的一致性。此外，研究结果的普遍性可能受所研究队列的地理与人口特征影响。多项调查来自特定区域队列，包括北美、南非与东欧人群，且常涉及社会弱势群体。尽管部分研究纳入了多元背景参与者，但大型多族裔队列仍然有限。此外，很少有研究具备足够效能来系统评估性别特异性效应，尽管已有新兴证据表明生物性别可能影响PAE后的免疫应答性与应激轴调节。
一个关键限制是单时间点评估占主导。大多数研究在出生时或婴儿早期评估生物标志物，未进行重复采样，限制了表征动态轨迹或区分短暂暴露特征与持久分子编程的能力。鉴于神经发育在多个敏感窗口展开，纵向生物标志物分析对于确定稳定性、演变及随时间推移的预测价值至关重要。
另一个缺口涉及多模态整合。尽管表观遗传、内分泌、免疫、RNA与蛋白质组改变各自与神经发育结局相关，但很少有研究在同一批个体中同时检验这些领域。因此，尚不清楚这些生物标志物反映的是共享的上游机制、平行但独立的通路，还是部分重叠的生物过程。可能需要系统层级的整合方法，包括基于网络的多组学分析，来定义具有更高特异度与预测性能的复合生物标志物特征。
重要的是，尽管许多生物标志物与神经发育结局存在统计学显著关联，但在人类观察性队列中无法推断因果关系。残余混杂、共同暴露（如烟草、心理社会应激）及出生后环境影响可能导致观察到的分子模式。精心设计、具有标准化神经发育评估、详细暴露量化及跨独立人群复制的纵向研究，对于确立时间方向性及确定所识别生物标志物是否具备真正预后价值至关重要。
3.5 对未来生物标志物驱动策略的启示
未来研究应优先考虑整合与纵向设计，结合发育各阶段的表观遗传、免疫、内分泌、血管及RNA生物标志物。多模态面板可能比单一分子指标更稳健地表征PAE后的神经发育风险与韧性。暴露评估、生物样本采集、分析流程及神经发育结局测量的标准化，对于实现跨队列验证及提高可重复性至关重要。
从转化角度看，胎盘、脐带血及外周体液中可检测的微创生物标志物，可能有助于解决PAE相关神经发育损伤常被低估的问题——这类损伤常逐步显现，且可能无显著身体特征。证据表明即使是低至中度暴露也与可测量的神经行为改变相关，这进一步支持了在干预仍可影响发育轨迹的阶段识别易感性的重要性。
尽管临床实施尚不成熟，跨独立队列的趋同性发现提示，分子生物标志物可支持更早的风险分层。朝着经验证、具有纵向预测性的生物标志物框架迈进，对于将发育编程研究转化为PAE背景下临床可操作的策略至关重要。
