《Analytical Methods》：The development of aptamer-functionalized streptavidin magnetic particles for sample purification of SARS-CoV-2 coupled with rapid plasmonic RT-qPCR to improve detection sensitivity
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尽管历史上经历过多次大流行，且当代技术不断进步，但世界对SARS-CoV-2病原体的出现仍准备不足。在有效疫苗开发和分发之前，卫生官员严重依赖诊断方法来遏制病毒传播。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）因其卓越的灵敏度和特异性而被用于诊断SARS-CoV-2。
尽管历史上经历过多次大流行，且当代技术不断进步，但世界对SARS-CoV-2病原体的出现仍准备不足。在有效疫苗开发和分发之前，卫生官员严重依赖诊断方法来遏制病毒传播。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）因其卓越的灵敏度和特异性而被用于诊断SARS-CoV-2。然而，由于鼻咽拭子储存于大体积病毒运输培养基中，且仅使用其中一小部分进行分析，SARS-CoV-2的临床样品制备技术可能限制了检测灵敏度。因此，研究人员开发了一种样品处理方法，通过使用功能化在磁珠上的针对S蛋白的适配体（“适配体磁珠”）捕获病毒颗粒，从而浓缩分析物，提高了SARS-CoV-2诊断的灵敏度和特异性。洗脱的病毒颗粒随后直接在Kimera P-IV即时检测等离子体qPCR平台上扩增。通过该方案，研究人员能够捕获各种形式的SARS-CoV-2分析物，包括武汉株和Omicron株的重组刺突蛋白、表达刺突蛋白的假病毒颗粒以及SARS-CoV-2病毒。此外，捕获方案可在短短2分钟内完成，并具有去除PCR反应中不需要的抑制成分的附加效果。总之，这种“适配体磁珠”样品纯化与快速等离子体PCR分析相结合，可在限制从样品到结果周转时间方面发挥关键作用，从而减缓传染病的传播。
论文解读：适配体磁珠联合等离子体RT-qPCR提升SARS-CoV-2检测性能
研究背景与意义
本研究发表于《Analytical Methods》。在COVID-19大流行期间，逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是诊断急性感染的“金标准”，具备优异的特异性与灵敏度。然而，现有检测流程面临两大瓶颈：一是检测周转时间长， centralized实验室检测需24至72小时；二是临床前处理效率低，例如Roche Cobas? 8800系统仅使用约1/8的原始样本进行核酸提取，且传统的玻璃磁珠缺乏靶向性，会共纯化鼻腔上皮细胞中的非病毒核酸，稀释目标病毒RNA浓度，同时裂解液引入的抑制剂也会影响后续扩增。因此，开发一种能够快速、特异地从复杂临床样本中纯化并富集病毒的方法，对于提升检测灵敏度、缩短周转时间具有重要意义。
关键技术方法
研究人员采用链霉亲和素磁珠（Streptavidin Magnetic Particles, SMPs）作为基底，通过生物素-链霉亲和素相互作用固定特异性识别SARS-CoV-2刺突蛋白（S-protein）的核酸适配体（Aptamer），制备成“适配体磁珠”（Apta-beads, ABs）。该技术利用适配体的高亲和力实现病毒的特异性捕获与富集。捕获后的病毒经洗涤去除杂质后，洗脱释放病毒RNA，最终在Kimera P-IV即时检测等离子体qPCR平台上进行分析。研究中使用了重组His标签刺突蛋白、表达S蛋白的鼠白血病假病毒（Pseudovirus）以及真实的SARS-CoV-2临床分离病毒株作为靶标，并在模拟临床基质（如尿液、细胞培养基、含EDTA缓冲液及鼻咽拭子稀释液）中验证了方法的鲁棒性。
研究结果
Apta-bead设计与表征
研究人员筛选了四种文献报道的靶向S蛋白受体结合域（RBD）或S1亚基的适配体序列（AB1-AB4），并对其进行修饰，引入内部六甘醇间隔区（iSp18）和生物素基团。通过评估不同适配体对武汉株和Omicron变异株刺突蛋白的捕获效率，发现AB1表现最优。进一步优化发现，在适配体末端添加15个胸腺嘧啶（15T）延伸链可增强其在复杂溶液中的结合能力，最终选定AB1-5′Bio+15T构型进行后续实验。
SMPs与ABs对等离子体qPCR的抑制效应
研究发现，虽然裸SMPs和高浓度ABs（25 μg）在传统热循环仪中不抑制PCR，但在Kimera P-IV等离子体qPCR平台中，高浓度磁珠会通过吸收激发光（488 nm）和发射光（525 nm）、干扰等离子体诱导的对流以及可能产生活性氧（ROS）等方式，显著降低荧光信号输出。因此，研究人员优化了流程，在将洗脱液加入PCR反应前，再次使用磁力架分离去除ABs，从而避免其对检测的干扰。
重组蛋白与假病毒的捕获验证
在理想条件和复杂临床模拟环境中，AB1均能有效捕获重组刺突蛋白。时间优化实验表明，仅需2分钟孵育即可实现高效捕获。对于表达S蛋白的假病毒，该方法能从1.5 mL体积中成功富集低至75个病毒颗粒的样本，其Ct值约为35.6，而未经富集的直接扩增对照组在此低浓度下无信号。该方法还能有效克服尿液、EDTA等已知PCR抑制剂的干扰，恢复扩增信号。
真实SARS-CoV-2病毒的检测
使用真实SARS-CoV-2病毒（滴度约1.77×10? PFU/mL）进行验证，ABs的捕获信号显著强于未修饰的裸磁珠对照，证明适配体在捕获中起主要作用。该方法对低至100 PFU的病毒量仍能实现有效检测，灵敏度与其他基于RNA提取的方案相当。整个前处理过程结合快速等离子体PCR分析，大幅缩短了从样本到结果的时间。
讨论与结论
本研究开发的适配体磁珠样本纯化技术，通过特异性识别并富集SARS-CoV-2病毒颗粒，实现了样本的快速浓缩与纯化，有效去除了PCR抑制物。将其与快速的Kimera P-IV等离子体qPCR平台联用，不仅提升了检测的灵敏度和特异性，更显著缩短了检测周期，为即时检测（POCT）场景提供了一个高效的解决方案。尽管该技术对病毒S蛋白突变较为敏感，未来需根据变异株更新适配体序列以维持最佳性能，但其模块化设计展示了广阔的应用潜力。该研究为应对未来可能的大流行，提供了一种快速、灵敏的病毒检测新策略。
