电纺纤维-微针复合贴片用于增强苯二氮?类药物及蛋白质经黏膜递送的研究

《Biomaterials Science》：Combined electrospun fibre-microneedle patches for enhanced transmucosal delivery of benzodiazepines and proteins

口腔黏膜血管丰富，可使药物快速吸收入体循环从而规避首过效应，但仅小分子脂溶性分子可经完整上皮渗透屏障。研究人员此前开发了电纺(electrospun)黏膜黏附贴片用于控释给药，虽延长了接触时间并改善了药物分布，但跨黏膜渗透仍局限于小分子脂溶性药物。将固体微针(microneedle, MN)与电纺贴片结合，可在物理破坏上皮屏障的同时递送载药量，克服单纯微针载药量低及单纯贴片渗透差的问题。本研究制备了一种黏膜黏附贴片与微针的复合材料，用于递送治疗癫痫持续状态(status epilepticus)需快速全身起效的苯二氮?类盐酸咪达唑仑(midazolam hydrochloride, HCl)及因分子量过大无法穿越上皮渗透屏障的抗原结合片段(antigen-binding fragment, f(ab))。研究人员采用反向微模塑法制备聚乳酸(polylactic acid, PLA)固体微针并优化用于颊黏膜渗透，通过光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)成像；将载咪达唑仑HCl或f(ab)的电纺黏膜黏附纤维与微针复合，以组织工程颊黏膜等效物(oral mucosal equivalent, OME)为模型，采用高效液相色谱(reverse phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)或酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)定量渗透量，荧光共聚焦显微镜(confocal fluorescence microscopy)观察分布。结果表明，与单纯电纺贴片对照组相比，微针介导的电纺贴片(EF-MN)增强了贴片滞留时间、药物递送速率及总渗透量，可使时间敏感的咪达唑仑在数分钟内快速递送，并使f(ab)在2小时内渗透量增加15倍，且能穿过上皮递送至其下固有层(lamina propria)。该研究证明微针介导的黏膜黏附贴片可增强难渗透药物的跨黏膜递送，在需快速全身起效的给药场景中具有显著潜力。

论文解读：电纺纤维-微针复合贴片用于增强苯二氮?类药物及蛋白质经黏膜递送的研究

本文发表于《Biomaterials Science》。口腔黏膜（尤其是非角化颊黏膜和舌下黏膜）血管丰富，药物经此吸收可避开肝脏首过代谢和胃肠道酶解，适合需快速起效或吞咽困难患者的给药。但目前经黏膜制剂多限于小分子脂溶性药物，临床常用咪达唑仑(midazolam)盐酸盐口服液在口腔易被唾液冲刷、易误吞导致剂量不准，且单纯电纺(electrospun, EF)黏膜黏附贴片无法使大分子蛋白（如抗体Fab片段 f(ab)）跨越上皮渗透屏障；而单纯微针(microneedle, MN)又受载药量限制。为此，研究人员构建了电纺纤维-微针复合装置（electrospun fibre-microneedle composite, EF-MN），旨在同步实现长时黏附、高载药及物理性突破上皮屏障以增强小分子药物快速吸收和蛋白大分子跨上皮递送。

主要关键技术方法：

研究人员通过聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)反向模塑并熔融浇铸聚乳酸(polylactic acid, PLA)制备三种长度（约300、500、750 μm模板对应成品约401、534、715 μm）的固体锥形微针，以维氏硬度(Vickers Hardness, HV)测试机械强度，光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)实时观察猪口腔黏膜穿刺及微孔闭合；以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone, PVP, MW 2000 kDa)与尤特奇RS100(Eudragit RS100, MW 32 kDa)电纺制备黏膜黏附纤维膜，分别负载5% w/w盐酸咪达唑仑(MDZ@EF)或0.013% w/w生物素化/德克萨斯红标记f(ab)片段(f(ab)@EF)；将微针阵列经基底侧刺入湿润EF制成EF-MN复合贴片。体外释放用RP-HPLC检测咪达唑仑、改良ELISA定量f(ab)；渗透实验分别以组织工程人颊黏膜等效物(tissue-engineered oral mucosal equivalent, OME，由永生化人颊角质形成细胞FNB6 hTERT气-液界面培养于I型胶原）和离体(ex vivo)猪颊黏膜Franz扩散池进行；OME中CYP3A4酶表达经免疫组化(immunohistochemistry, IHC)确认；f(ab)穿透深度用荧光共聚焦显微镜观察；滞留时间于37℃振摇条件下记录EF、MN及EF-MN从离体猪颊黏膜脱落时间；统计学采用Shapiro–Wilk正态检验后行t检验、Wilcoxon符号秩检验或ANOVA加Tukey事后检验。

3.1 Microneedle manufacture with optimal length for penetration through the oral mucosa

研究人员测量人及猪颊、龈、口底(floor of the mouth, FOM)上皮厚度（人颊上皮约712±5 μm，猪颊约935±75 μm等），据此设计三种尺寸PLA微针。扫描电镜(scanning electron microscopy, SEM)显示微针尖端锐利、三维形貌规整，实测长度401±36 μm（小）、534±27 μm（中）、715±30 μm（大），维氏硬度15.98±0.78 HV。OCT显示大号微针可穿透猪颊上皮至固有层(lamina propria)，移除后5分钟微孔仍可见；H&E染色证实微针穿刺形成贯穿上皮的微通道，验证了微针对口腔黏膜上皮的物理穿透能力。

3.2 Midazolam HCl-loaded mucoadhesive electrospun fibres fabrication and characterisation

含5% w/w咪达唑仑HCl的MDZ@EF纤维直径(2.3±0.5 μm)、厚度(约180 μm)、单位面积质量(约4.70 mg/?10 mm)、2小时PBS溶胀率(262±9%)与空白EF无显著差异，说明载药未破坏电纺膜基本理化性质，每片含咪达唑仑HCl约235±20 μg。

3.3 An electrospun fibre-microneedle composite device increases the residency time to ex vivo oral mucosa

EF单独滞留时间为2.3±0.6小时，微针单独及EF-MN复合贴片均延长至约6.7–7.0小时（p<0.05），表明微针的机械锚定作用显著提升装置在湿润口腔黏膜上的黏附滞留能力。

3.4 Midazolam delivered from the electrospun fibres-microneedle composite increases the rate of permeation through oral mucosa

MDZ@EF在PBS中2小时累积释放约51±11%，前5分钟释放18.8±5.4%。经OME渗透实验显示MDZ@EF-MN在15分钟时咪达唑仑渗透量较MDZ@EF提高约1.17倍（p<0.05），2小时总体渗透显著增加（p<0.05）。离体猪颊Franz扩散池实验中，MDZ@EF-MN组接收液中检出透过量（中位0.4 μg，p<0.01），而单纯MDZ@EF组未检出可量化透过量；组织中滞留量两组无差异，说明微针主要通过建立微孔使药物得以进入体循环侧。

3.5 Midazolam is metabolised in the oral mucosa by CYP3A4 and CYP3A5

OME及人颊黏膜IHC证实CYP3A4表达于上皮尤其基底层角质形成细胞。OME渗透接收液中除咪达唑仑外检出其主要代谢产物1-羟基咪达唑仑(1-hydroxymidazolam)，MDZ@EF组总透过物（原药+代谢物）为89.5%，MDZ@EF-MN组为96.5%，说明OME可模拟口腔局部药物代谢，微针介导快速递送可能减少药物在上皮内停留及代谢损失。

3.6 F(ab)-loaded mucoadhesive electrospun fibres manufacture and characterisation

f(ab)@EF纤维直径与空白EF无差异，膜厚约75.6 μm，单片含f(ab)约298.66 ng（0.013% w/w），2小时PBS溶胀率400±160%（高于空白EF的165.5%，p<0.01），荧光显微镜显示Texas Red标记f(ab)呈聚集体分布于纤维中。

3.7 F(ab) delivered from the electrospun fibre-microneedle composite increases permeation through buccal mucosa

f(ab)@EF在PBS中2小时累积释放约57.9±1.3%。OME渗透实验显示单纯f(ab)@EF 2小时透过多中位0.25 ng，而f(ab)@EF-MN为3.87 ng（p<0.05），提升约15倍；15分钟时EF-MN组已可检出透过f(ab)（2.45 ng），EF组未检出。荧光共聚焦显示微针使f(ab)经微孔进入上皮周缘并深入至上皮下层，证实微针可克服完整上皮对大分子蛋白的渗透屏障。

讨论与结论总结

单纯电纺黏膜黏附贴片虽延长接触时间，但无法使大分子透上皮，且小分子药物渗透速率有限；单纯微针载药量低。本研究将固体PLA微针与PVP/Eudragit RS100电纺载药纤维复合，微针物理穿刺上皮建立微通道，电纺膜提供高载药储库及黏膜黏附，两者协同使贴片滞留时间延至7小时以上，咪达唑仑在关键治疗窗（15分钟）内渗透速率显著提升，f(ab)片段2小时内跨上皮渗透增加15倍并可递入固有层，为首个报道微针介导f(ab)跨越完整口腔上皮的研究。组织工程OME中检出CYP3A4介导的咪达唑仑代谢，提示该模型可用于口腔局部药物代谢研究。综上，微针介导的电纺纤维黏膜黏附贴片可有效克服跨黏膜给药中滞留时间短、渗透屏障限制及微针载药量不足三大瓶颈，为需快速全身吸收的小分子急救药及以往只能注射给药的大分子蛋白（如抗体片段）提供了一种微创、患者友好型的经口腔黏膜递送新策略，具有重要的转化潜力。