《Journal of Biological Chemistry》：Global identification of Chromobacterium violaceum T6SS effectors reveals an Rhs antibacterial toxin featuring FIX and ADP-ribosyltransferase domains
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细菌以多微生物群落形式共存，在此类群落中它们存在复杂的相互作用，包括细菌间拮抗。环境细菌病原体紫罗兰色杆菌（*Chromobacterium violaceum*）拥有一个活跃的VI型分泌系统（Type VI Secretion System，T6SS），其活
细菌以多微生物群落形式共存，在此类群落中它们存在复杂的相互作用，包括细菌间拮抗。环境细菌病原体紫罗兰色杆菌（*Chromobacterium violaceum*）拥有一个活跃的VI型分泌系统（Type VI Secretion System，T6SS），其活性及在细菌间竞争中的功能主要依赖于VgrG3。然而，该T6SS所递送的毒性效应物库仍然未知。在此，研究人员鉴定了紫罗兰色杆菌T6SS效应物的全谱，并表征了一种新型的抗菌Rhs家族效应物，即RhsF（含有FIX域的Rhs蛋白），及其同源免疫蛋白RhsFi。通过对分泌蛋白以及与VgrG3共免疫沉淀的蛋白进行质谱分析，研究人员鉴定了六个新的候选效应物，具体为四种磷脂酶、一个功能未知蛋白以及一个此前未被表征的Rhs蛋白RhsF（CV_1431）。RhsF含有一个N端FIX域，并能够以T6SS依赖的方式使易感细菌中毒。RhsF C端毒素域（RhsF C-terminal toxin domain，RhsF-CT）的作用被RhsFi（CV_1430）所阻止，这证实RhsF-RhsFi构成一个效应物-免疫对。通过X射线晶体学（分辨率1.85 ?）解析的RhsF-CT/RhsFi复合体结构揭示，RhsF-CT与ADP-核糖基转移酶（ADP-ribosyltransferase）毒素具有结构相似性，且RhsFi通过直接封闭RhsF-CT催化位点来抑制其毒性。功能实验表明，RhsF-CT可在体外对RNA进行ADP-核糖基化修饰，并且RhsF的毒性需要一个由R1403、Y1456和E1497残基组成的催化三联体。综上所述，研究人员的发现揭示了由紫罗兰色杆菌T6SS分泌的效应物，确立了RhsF作为一种强效的抗菌毒素，并证实了含有FIX域的Rhs蛋白能够以T6SS依赖的方式递送，从而扩展了已知的参与微生物竞争的细菌武器库。
### 论文解读：紫罗兰色杆菌T6SS效应物的全局鉴定与新型Rhs抗菌毒素RhsF的功能与结构研究
#### 研究背景
细菌在自然界中常以多微生物群落的形式存在，其间充满复杂的相互作用，包括激烈的细菌间竞争。为在竞争中占据优势，许多革兰氏阴性菌进化出了VI型分泌系统（T6SS）。T6SS是一种类似收缩性噬菌体尾部的纳米机器，能够将毒性效应蛋白直接注入邻近的竞争细菌细胞内，是细菌间干扰竞争的关键武器。紫罗兰色杆菌（*Chromobacterium violaceum*）是一种环境病原体，能引起人类和动物的致命感染。此前研究已揭示，紫罗兰色杆菌ATCC 12472菌株拥有一个受群体感应调控的T6SS，其中VgrG3蛋白在该系统的活性及介导的细菌杀伤中起着最关键的作用。然而，该T6SS所递送的抗菌效应物的完整组成尚不清楚。因此，本研究旨在系统性鉴定紫罗兰色杆菌T6SS分泌的效应物，并深入表征其中一个新型Rhs家族毒素的作用机制，以加深对细菌通过T6SS进行竞争的分子基础的理解。本论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
#### 主要关键技术与方法
本研究采用了两种互补的蛋白质组学策略：（1）**无标记定量质谱分析**：比较野生型紫罗兰色杆菌与*ΔtssB*突变株（T6SS失活株）培养上清液中的分泌蛋白，鉴定T6SS依赖性分泌的蛋白；（2）**免疫共沉淀结合质谱分析（Co-IP/MS）**：构建VgrG3-C端HA标签融合蛋白菌株，通过抗HA抗体磁珠富集与VgrG3相互作用的蛋白。此外，研究还运用了**X射线晶体学**解析RhsF-CT/RhsFi复合体的高分辨率（1.85 ?）三维结构，并结合**定点突变**、**异源表达毒性实验**和**体外ADP-核糖基化活性测定**等生化与细胞生物学方法，对候选效应物RhsF的功能和抑制机制进行了验证和表征。本研究的菌株来源均为实验室保存和构建的菌株。
#### 研究结果
**1. 全局鉴定紫罗兰色杆菌T6SS分泌的效应物**
通过分泌组学（Secretomics）和Co-IP/MS两种策略，研究人员鉴定出多个依赖T6SS的蛋白，共计六个新的候选效应物：四种磷脂酶（Tle1家族，由基因*CV_3990*、*CV_3971*、*CV_0012*编码；Tle5家族，由基因*CV_1234*编码），一个功能未知的假定蛋白（由基因*CV_2125*编码），以及一个此前未被表征的Rhs家族蛋白（由基因*CV_1431*编码，后命名为RhsF）。此外，还鉴定了三种Tap-1衔接蛋白、两个新的PAAR蛋白以及全部六种VgrG蛋白。此结果证实了紫罗兰色杆菌的单一T6SS能够利用多种VgrG蛋白来递送一个庞大的效应物库。
**2. RhsF是一种由T6SS递送并由RhsFi中和的抗菌毒素**
基因*rhsF*与*vgrG3*和编码假定蛋白*rhsFi*的基因构成一个可能的操纵子。结构域分析显示RhsF具有典型的Rhs蛋白模块化架构，包含一个N端FIX域、一个中心Rhs核心重复区域，以及一个C端毒素域（RhsF-CT）。在*E. coli*中诱导表达RhsF-CT会使细胞生长受到严重抑制，而与RhsFi共表达则能完全解除这种毒性，证实RhsF-RhsFi构成一个效应物-免疫蛋白对。在胞内竞争实验中，靶菌株（*ΔrhsF/Fi*）与野生型紫罗兰色杆菌共培养后的回收率比与*ΔtssB*、*ΔvgrgG3*或*ΔrhsF*攻击菌共培养时低约4个数量级，证明RhsF的递送依赖于T6SS和VgrG3。在跨物种竞争中，敲除*rhsF*会显著降低紫罗兰色杆菌对*P. aeruginosa* PA14和*E. coli*的杀伤能力，表明RhsF在T6SS分泌的毒素中发挥重要作用。
**3. RhsF-CT/RhsFi复合体的结构提供了毒素抑制的见解**
通过X射线晶体学解析的RhsF-CT/RhsFi复合体结构显示，RhsF-CT由β-折叠片和α-螺旋构成，整体结构与ADP-核糖基转移酶（ART）毒素高度相似。而免疫蛋白RhsFi由六个α-螺旋组成。两者以1:1的化学计量比结合，RhsFi通过其α6螺旋上的R102和W103残基直接插入并封闭RhsF-CT上的一个正电性口袋（即推测的催化位点），形成氢键和盐桥网络，从而抑制毒素活性。
**4. RhsF-CT具有ADP-核糖基转移酶结构特征并在体外修饰RNA**
结构比对显示，RhsF-CT与已知的ART蛋白，如*Streptomyces coelicolor*的ScARP和*E. coli*的EcPltA，具有显著的保守结构核心。体外ADP-核糖基化实验表明，纯化的RhsF-CT在NAD
+存在下能够修饰RNA寡核苷酸，并且该修饰可以通过抗-poly/mono-ADP核糖抗体检测到，而RhsFi的存在则会完全抑制此活性。这表明RhsF-CT是一种能够对RNA进行ADP-核糖基化的ART。
**5. RhsF-CT的活性位点包含一个非典型的R-Y-E催化三联体**
通过对关键残基的突变分析发现，将预测的催化三联体残基R1403、Y1456或E1497中任一个突变为丙氨酸均导致RhsF-CT完全失去毒性，而突变S1445只造成毒性部分降低。免疫印迹实验排除了这些突变影响蛋白稳定性的可能性。这些结果证实了RhsF-CT是一个以非典型R-Y-E（而非经典的H-Y-E或R-S-E）为催化三联体的ADP-核糖基转移酶，其中R1403、Y1456和E1497是其发挥毒性所必需的。
#### 讨论与结论
本研究通过结合分泌组学和免疫共沉淀两种互补策略，首次全面鉴定了紫罗兰色杆菌T6SS的效应物库，发现了多种类型的候选效应物，包括磷脂酶和新蛋白，极大地拓展了对该病原菌T6SS武器库的认识。研究重点聚焦于一种新型Rhs家族毒素RhsF，发现其N端存在一个FIX域，而不是常见的PAAR域。Co-IP数据暗示RhsF可能通过与VgrG3的TTR样域直接相互作用而分泌。这项研究提供了实验证据，证明FIX域可以作为替代PAAR域的递送信号，指导含有Rhs的效应物通过T6SS分泌。此外，高分辨率晶体结构揭示了RhsF-CT具有典型的ART折叠，并阐明了其免疫蛋白RhsFi通过直接阻塞催化位点的中和机制。体外活性实验证明RhsF-CT具有独特的对RNA进行ADP-核糖基化的能力，其催化位点由一个非典型的R-Y-E三联体构成。
**研究结论翻译：** 本研究的发现揭示了由紫罗兰色杆菌T6SS分泌的效应物，确立了RhsF作为一种强效的抗菌毒素，并证实了含有FIX域的Rhs蛋白能够以T6SS依赖的方式递送，从而扩展了已知的参与微生物竞争的细菌武器库。
