拉帕替尼(Lapatinib)通过SLC1A5-GPX4轴诱导骨肉瘤发生铁死亡(Ferroptosis)

《Journal of Bone Oncology》：Lapatinib induces ferroptosis in osteosarcoma via the SLC1A5-GPX4 axis

　　

背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)预后仍较差，亟需新型治疗策略。铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性调节性细胞死亡形式，为规避凋亡耐药提供了有前景的替代方案。拉帕替尼(Lapatinib, Lap)是已知的EGFR/HER2抑制剂，其潜在作用超越经典靶点。方法：研究人员采用CCK-8、克隆形成、Transwell及流式细胞术检测拉帕替尼对U2OS和HOS细胞系的抗OS效应；通过分子对接(molecular docking)、分子动力学模拟(molecular dynamics simulations)、细胞热转移分析(Cellular Thermal Shift Assay, CETSA)及药物亲和响应靶标稳定性分析(Drug Affinity Responsive Target Stability, DARTS)鉴定潜在靶点；测定铁死亡关键标志物（丙二醛[MDA]、还原型谷胱甘肽[GSH]、Fe2+、脂质活性氧[lipid ROS]）及相关蛋白（SLC1A5、谷胱甘肽过氧化物酶4[GPX4]）评估铁死亡诱导情况；建立异种移植小鼠模型验证体内铁死亡诱导作用。结果：拉帕替尼显著抑制OS细胞增殖、迁移和侵袭，主要通过铁死亡诱导细胞死亡；其升高脂质过氧化并触发铁死亡特征性事件（Fe2+蓄积、脂质ROS升高、GSH耗竭），均被铁死亡抑制剂去铁胺(deferoxamine, DFO)逆转；SLC1A5敲减减弱、而过表达 rescued 拉帕替尼诱导的铁死亡，证实SLC1A5是功能性靶点；分子对接、CETSA及DARTS支持拉帕替尼与SLC1A5潜在相互作用；机制上拉帕替尼破坏谷氨酰胺(glutamine, Gln)摄取和GSH合成，导致GPX4抑制及铁死亡；体内实验显示拉帕替尼抑制肿瘤生长并下调SLC1A5/GPX4，该效应可被DFO逆转。结论：本研究揭示了拉帕替尼通过SLC1A5-GPX4轴诱导铁死亡抑制OS的新机制，为拉帕替尼老药新用(repurposing)治疗骨肉瘤提供了临床前依据。

论文解读：Lapatinib induces ferroptosis in osteosarcoma via the SLC1A5-GPX4 axis

研究背景与意义

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是最常见的原发性骨恶性肿瘤，常规化疗因固有或获得性耐药导致高复发率及不良预后，亟需新治疗范式。铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖的、非凋亡形式的调节性细胞死亡，由铁催化脂质过氧化物累积驱动，可被谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4, GPX4）所拮抗，为克服凋亡耐药提供了新思路。溶质载体家族1成员5（Solute Carrier Family 1 Member 5, SLC1A5/ASCT2）是细胞膜谷氨酰胺（Glutamine, Gln）转运蛋白，其介导的Gln摄取是合成还原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione, GSH）的关键步骤，已有研究表明SLC1A5可调控铁死亡。拉帕替尼（Lapatinib）是口服EGFR/HER2双酪氨酸激酶抑制剂，除经典靶点外是否具有诱导铁死亡的非经典作用及其在OS中的机制尚不清楚。本研究首次探讨拉帕替尼是否通过靶向SLC1A5诱导OS铁死亡，论文发表于《Journal of Bone Oncology》。

主要技术方法

研究人员采用人骨肉瘤细胞系U2OS和HOS进行体外实验，并以BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型（HOS细胞接种）进行体内验证。关键实验技术包括：CCK-8法测细胞活力、克隆形成实验、Transwell及划痕实验测迁移侵袭、Annexin V-FITC/PI及Calcein-AM/PI染色检测细胞死亡、FerroOrange探针测胞内Fe²⁺、C11-BODIPY^581/591探针测脂质活性氧（lipid ROS）、生化试剂盒测GSH/MDA/Gln水平；分子对接（AutoDockTools）及100 ns分子动力学模拟（GROMACS）、AlphaFold3预测蛋白-配体复合物；细胞热转移分析（CETSA）和药物亲和响应靶标稳定性分析（DARTS）验证蛋白-小分子相互作用；Western blot检测SLC1A5及GPX4蛋白表达；SLC1A5 siRNA敲减及过表达质粒转染验证功能；免疫组化（IHC）及HE染色分析移植瘤组织。

研究结果

3.1. Lapatinib suppresses proliferation, migration, invasion and induces cell death

拉帕替尼以剂量和时间依赖性显著抑制U2OS和HOS细胞活力（IC₅₀分别为6.26 μM和8.3 μM），降低克隆形成能力，抑制迁移和侵袭，Annexin V/PI染色显示细胞死亡率显著升高，表明拉帕替尼有效拮抗OS细胞恶性表型。

3.2. Lapatinib-induced ferroptosis is rescued by DFO

铁死亡抑制剂去铁胺（Deferoxamine, DFO）比凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死性凋亡抑制剂Nec-1更显著挽救拉帕替尼引起的活力丧失。透射电镜见线粒体缩小、膜密度增加、嵴减少等铁死亡典型超微结构改变，被DFO逆转。拉帕替尼引起胞内Fe²⁺蓄积、脂质ROS升高、MDA升高及GSH耗竭，均被DFO回救，证实铁死亡是拉帕替尼诱导OS细胞死亡的主要方式。

3.3. Lapatinib induces ferroptosis by suppressing GPX4

拉帕替尼显著降低GPX4蛋白水平，该下调被DFO逆转；GPX4过表达显著减弱拉帕替尼诱导的细胞死亡、总ROS及脂质过氧化物累积，确认GPX4抑制是拉帕替尼触发铁死亡的关键环节。

3.4. Lapatinib interacts with SLC1A5

分子对接显示拉帕替尼可结合于SLC1A5底物结合口袋（结合自由能?8.6 kcal/mol），100 ns分子动力学模拟显示复合物RMSD稳定、结合界面波动低、维持平均约4个氢键，自由能景观具深势阱；AlphaFold3预测复合物具高置信度，提示拉帕替尼与SLC1A5存在潜在相互作用。

3.5. The SLC1A5-GPX4 axis mediates lapatinib-induced ferroptosis

CETSA显示拉帕替尼处理使SLC1A5热稳定性增强，DARTS显示SLC1A5对蛋白酶解抵抗增强，证明二者潜在物理结合。拉帕替尼下调SLC1A5蛋白且该下调被DFO逆转。SLC1A5过表达回救拉帕替尼引起的细胞死亡、Fe²⁺蓄积及GPX4下调，并恢复胞内Gln和GSH水平；SLC1A5 siRNA敲减则减弱拉帕替尼引起的GPX4下调及细胞毒性。表明拉帕替尼通过作用于SLC1A5阻断Gln摄取→GSH合成↓→GPX4失活→铁死亡。

3.6. Lapatinib suppresses tumor growth by activating ferroptosis in vivo

HOS异种移植瘤模型中，拉帕替尼（25 mg/kg/d，腹腔注射）显著抑制肿瘤体积和重量，降低Ki-67增殖指数，下调瘤组织SLC1A5和GPX4蛋白，血浆MDA升高、GSH降低；上述效应均被DFO（10 mg/kg/d）共处理逆转，证实拉帕替尼在体内通过激活铁死亡抑制OS生长。

讨论与结论翻译

本研究发现拉帕替尼通过靶向SLC1A5（非经典EGFR/HER2通路）干扰谷氨酰胺代谢致GSH耗竭、GPX4抑制而诱导骨肉瘤铁死亡，双向遗传学及CETSA/DARTS验证了SLC1A5为功能性靶点。虽伴随轻微凋亡，铁死亡是主导死亡模式。此结果为拉帕替尼老药新用治疗骨肉瘤提供了临床前依据，SLC1A5-GPX4轴是骨肉瘤可靶向脆弱位点。

结论原文翻译：综上所述，本研究阐明拉帕替尼一种不依赖于其经典靶点（EGFR/HER2）的新机制——拉帕替尼与SLC1A5相互作用，破坏谷氨酰胺代谢和GSH合成，使GPX4失活并最终触发铁死亡（Ferroptosis）。铁死亡在拉帕替尼诱导的细胞死亡中起主导作用，凋亡可能亦有贡献。本研究将SLC1A5-GPX4轴确立为骨肉瘤中可治疗的脆弱靶点，为进一步评估拉帕替尼老药新用（Repurposing）提供了临床前依据。