原料乳中前列腺素(prostaglandins, PGs)的检测及加工工艺对其稳定性的影响

《Journal of Dairy Science》：Detection of prostaglandins in raw milk and the effect of processing technology on its stability

摘要：本研究建立了一种固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾电离-串联三重四极杆质谱(solid-phase extraction-ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry, SPE-LC-ESI-MS/MS)方法，用于测定牛乳中天然存在的前列腺素(dinoprost，即PGF2α)及其合成类似物氯前列醇(cloprostenol)。并对该方法进行验证，考察脱脂、巴氏杀菌(pasteurization)、超高温瞬时灭菌(ultra-high temperature sterilization, UHT)、喷雾干燥(spray drying)及冷冻(freezing)5种加工工艺对外源性添加激素在原料乳中稳定性的影响。结果显示：在0–100 ng/mL浓度范围内，方法的检出限(limit of detection, LOD)为0.04–0.12 ng/mL，定量限(limit of quantitation, LOQ)为0.11–0.37 ng/mL，线性关系良好(R2＞0.99)。加工实验表明，喷雾干燥和超高温瞬时灭菌后两种前列腺素的加标回收率均低于10%，可能与前列腺素自身的理化性质有关；而冷冻处理对两种前列腺素的残留率几乎无影响。

论文解读：

《Detection of prostaglandins in raw milk and the effect of processing technology on its stability》发表于《Journal of Dairy Science》。前列腺素F_2α(prostaglandin F_2α, PGF_2α)是动物体内重要的类花生酸(eicosanoids)信号分子，因其溶解黄体(luteolysis)作用被广泛用于奶牛同期发情(estrus synchronization)程序，其残留可能随原料乳进入人体并带来潜在健康风险。已有研究表明类固醇激素在乳中较耐热，而肽类和胺类激素热稳定性差，但迄今尚无针对原料乳中PGF_2α及其合成类似物氯前列醇(cloprostenol)的系统检测方法及不同乳制品加工工艺对其稳定性影响的报道。为此，研究人员Ruqing Lu等人开发并验证了基于固相萃取-超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱(solid-phase extraction-ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry, SPE-UPLC-ESI-MS/MS)的检测方法，并以加标原料乳为对象考察了5种常见乳品加工工艺对两种前列腺素残留稳定性的影响，为奶畜用药后痕量残留监测及评估加工过程对激素残留风险的削减作用提供技术依据。

主要关键技术方法：研究人员采集当地合作牧场原料乳作为空白基质，以dinoprost(PGF_2α)和cloprostenol为标准品，经甲醇沉淀蛋白、酸化后上Oasis Prime HLB固相萃取(solid-phase extraction, SPE)小柱净化富集，氮吹复溶后进行UPLC-ESI(-)-MRM MS/MS分析；按欧盟2002/657/EC决策要求验证方法的专属性(specificity)、线性、检出限(LOD, S/N=3)、定量限(LOQ, S/N=10)、精密度(日内及日间)、加标回收率(spiked recovery)及基质效应(matrix effect, ME)；另将加标(约100 ng/mL)原料乳分别进行脱脂(2200×g, 15 min)、巴氏杀菌(72℃, 30 min)、超高温瞬时灭菌(135℃, 5 s)、喷雾干燥(进风180℃/出风80℃)及冷冻(?20℃过夜)处理，以LC-MS/MS检测处理前后目标物信号强度并计算残留率，采用单因素方差分析(One-way ANOVA, P＜0.05为显著)进行统计学处理。

研究结果如下：

质谱条件与离子对信息(Mass Spectrometry Conditions and Ion Pair Information)：研究人员选择负离子模式多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)，确定dinoprost定量离子对为353.1→317.1(CE ?26 V)和353.1→193.0(CE ?34 V)，保留时间1.11 min；cloprostenol定量离子对为423.1→126.8(CE ?35 V)和423.1→295.2(CE ?25 V)，保留时间0.99 min。UPLC采用BEH C₁₈柱及含0.1%氨水的甲醇/水(9:1, v/v)流动相，可有效分离目标物并减少基质离子抑制。

检出限与线性(Lower Limit of Detection and Linearity)：用空白乳基质配制0.1、1、10、50、100 ng/mL系列标准溶液，dinoprost和cloprostenol的校准曲线相关系数分别为R²=0.9919和R²=0.9996，LOD为0.04–0.12 ng/mL，LOQ为0.11–0.37 ng/mL，在0–100 ng/mL范围内线性良好，符合ICH一般接受标准。

专属性(Specificity)：空白流动相及空白乳中cloprostenol无目标峰；空白原料乳检出痕量内源性PGF_2α，证实乳中可存在生理性PGF_2α；标准品与加标乳样均在对应保留时间出峰且无干扰，方法特异性良好。

精密度(Precision)：在0.1、20、100 ng/mL三个浓度水平进行日内(n=3/浓度/化合物)和日间(d 1–d 5, n=2/浓度/化合物/天)测试，dinoprost与cloprostenol的平均测定浓度均在理论值的85%–115%内，相对偏差符合要求，方法重复性与中间精密度良好。

加标回收率(Spiked Recovery Rate)：于空白乳中分别添加20、40、100 ng/mL标准溶液(n=3)，经SPE前处理后dinoprost回收率为96.10%–96.55%，cloprostenol为92.72%–97.21%，表明所建SPE净化富集方法可靠。

基质效应(Stromal Effect / Matrix Effect)：cloprostenol以纯溶剂与基质匹配标准曲线斜率比计算ME为?8.02%；PGF_2α因个体乳样差异采用1:1混合加入法测得ME为?12%。两者均在±20%可接受范围内，基质效应可忽略。

稳定性(Stability)：10 ng/mL标准溶液避光?20±5℃保存30 d后与新鲜配制溶液响应值差异＜5%(P＞0.05)，表明标准储备液在该条件下至少可稳定保存1个月。

加工参数影响(Influence of Processing Parameters)：加标(≈100 ng/mL)dinoprost与cloprostenol经5种工艺处理后，喷雾干燥使dinoprost损失?98.5%、cloprostenol?93.2%，UHT使dinoprost损失?94.9%、cloprostenol?96.3%，高温致PGs热降解及与变性乳蛋白结合或氧化可能是主要原因；脱脂使dinoprost残留率降至约30%(损失?67%)、cloprostenol?69%，归因于PGF_2α及类似物的两亲性——脂溶性部分富集于乳脂肪并随脂肪相被移除；巴氏杀菌对dinoprost损失?65%、对cloprostenol损失?33%，后者因15位羟基受保护及分子骨架修饰具更高热稳定性；冷冻(?20℃)对两种前列腺素的残留率影响可忽略。

讨论与结论总结：研究人员指出，本方法灵敏度(LOD 0.04–0.12 ng/mL)、准确度(回收率92%–97%)及特异性可满足原料乳中痕量PGF_2α与cloprostenol定性定量分析需求，并能区分天然与合成类似物。加工试验揭示高温处理(UHT及喷雾干燥)可基本消除两种前列腺素残留(回收率＜10%)，脱脂可去除大部分与脂肪结合的残留，巴氏杀菌造成不同程度降解且合成类似物更耐热，冷冻不影响残留水平。结论原文译为：本研究建立并验证了固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾电离-串联三重四极杆质谱(SPE-UPLC-ESI-MS/MS)法用于定量乳中两种PGF_2α类物质。该方法在0–100 ng/mL浓度范围内线性良好(R²＞0.99)，仪器检出限为0.04–0.12 ng/mL，定量限为0.11–0.37 ng/mL。喷雾干燥和超高温瞬时灭菌后加标乳样的回收率降至10%以下，脱脂乳回收率约为30%，可能与PGF_2α自身性质有关；相反，冷冻处理对两种化合物的残留水平几乎无影响。本研究可为精细化畜牧管理、乳制品安全风险监测及相关科学研究提供更准确、便捷的分析工具。