枣（*Ziziphus jujuba* Lamk.）果实中的五环三萜类化合物作为PTP1B和α-葡萄糖苷酶的双重抑制剂：体外和计算机模拟评价

《RSC Advances》：Pentacyclic triterpenoids from Ziziphus jujuba Lamk. fruits as dual inhibitors of PTP1B and α-glucosidase: in vitro and in silico evaluations

　　

枣（*Ziziphus jujuba* Lamk.，Táo Ta）在亚洲传统医学中被广泛用作超级水果。枣果实的乙醇提取物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）表现出显著的抑制作用，并通过生物活性导向的分离，鉴定出15种活性三萜类化合物（1–15），即：白桦脂酸（betulinic acid，1）、科罗索酸（corosolic acid，2）、齐墩果酸（oleanolic acid，3）、蛇藤酸（alphitolic acid，4）、山楂酸（maslinic acid，5）、3-O-顺式-对香豆酰基蛇藤酸（3-O-*cis*-*p*-coumaroyl alphitolic acid，6）、3-O-反式-对香豆酰基蛇藤酸（3-O-*trans*-*p*-coumaroyl alphitolic acid，7）、2-O-反式-对香豆酰基蛇藤酸（2-O-*trans*-*p*-coumaroyl alphitolic acid，8）、2-O-顺式-对香豆酰基蛇藤酸（2-O-*cis*-*p*-coumaroyl alphitolic acid，9）、美洲茶酸（ceanothic acid，10）、枣叶酸（zizyberanalic acid，11）、反式-对香豆酰基白桦脂酸（*trans*-*p*-coumaroyl betulinic acid，12）、桦木酮酸（betulonic acid，13）、熊果酸（ursolic acid，14）和齐墩果酮酸（oleanonic acid，15）。它们的化学结构通过核磁共振（NMR）波谱学鉴定，并与已报道的文献进行比较。在测试其对PTP1B和α-葡萄糖苷酶作用的化合物中，化合物1–3显示出最强的抑制活性，其半数抑制浓度（IC₅₀）值范围为6.75至17.02 μM。此外，化合物4、10和13表现出较弱的PTP1B抑制活性（IC₅₀ = 53.42至90.90 μM），而化合物5–15在所有测试浓度下均未显示抑制作用。此外，研究人员进行了分子对接和分子动力学模拟，以评估化合物1–3与PTP1B和α-葡萄糖苷酶（两种参与葡萄糖稳态的关键酶）的结合亲和力。这些相互作用可能有助于调节胰岛素信号通路和餐后血糖水平，从而改善糖尿病的血糖控制。此外，计算机模拟的ADME和毒性预测进一步表明，化合物1–3具有有利的药代动力学特性和较低的预测毒性。这些发现为利用产自越南的枣开发潜在的PTP1B和α-葡萄糖苷酶双重抑制剂提供了合理依据，值得进一步研究，并被认为是关于该物种化学和生物活性研究的首次报道。

**研究背景**
枣（*Ziziphus jujuba* Lamk.）作为一种传统药物，其果实具有多种生物活性，但关于其抗糖尿病活性及具体化学成分的研究，特别是针对蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）和α-葡萄糖苷酶双重抑制活性的研究尚不充分。PTP1B是胰岛素信号通路的负调控因子，其抑制可增强胰岛素敏感性；而α-葡萄糖苷酶抑制剂则能延缓碳水化合物吸收，控制餐后血糖。尽管已知某些五环三萜类化合物如齐墩果酸具有PTP1B抑制活性，但针对越南产的枣果实中该成分的系统性研究，尤其是多项三萜在相同条件下的比较活性评估鲜有报道。本研究旨在首次系统性探索越南枣果实中的五环三萜类化合物，并通过体外实验和计算机模拟评估其作为PTP1B和α-葡萄糖苷酶双重抑制剂的潜力。
**主要研究发现**
研究人员采用生物活性导向分离策略，从枣果实的乙醇提取物中成功分离并鉴定了15种五环三萜类化合物（1–15）。通过体外酶活性测试发现，化合物1（白桦脂酸）、2（科罗索酸）和3（齐墩果酸）表现出最强的PTP1B和α-葡萄糖苷酶双重抑制活性，其IC₅₀值处于低微摩尔范围。分子对接和分子动力学模拟揭示了这些化合物与两种酶活性位点的稳定结合模式，结合自由能计算进一步支持了其相互作用。结构-活性关系（SAR）分析表明，C-28羧酸基团和C-3羟基对抑制活性至关重要，而C-2位额外羟基的存在（如化合物2）则显著增强了结合力和抑制效力。计算机预测的ADME和毒性分析显示，这三种化合物具有良好的类药性和较低的急性毒性。
**论文意义**
该研究首次全面报道了越南枣果实中五环三萜类化合物作为PTP1B和α-葡萄糖苷酶双重抑制剂的潜力，为从天然产物中发现新型抗糖尿病先导化合物提供了科学依据。论文发表在《RSC Advances》。
**主要技术方法**
1. **生物活性导向分离**：通过乙醇提取、液-液分配、正相（NP）和反相（RP）柱色谱、Sephadex LH-20凝胶过滤及制备型高效液相色谱（HPLC）技术，从枣果实（采集自越南同塔省）中分离15个三萜类化合物。
2. **结构鉴定**：利用核磁共振（¹H和¹³C NMR）波谱学解析化合物结构，并与文献数据比对确认。
3. **体外酶抑制实验**：分别测定化合物对PTP1B和α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度（IC₅₀）。
4. **计算机模拟**：采用分子对接（AutoDock Vina）和分子动力学模拟（GROMACS，100 ns）评估化合物与靶蛋白的结合模式和稳定性，并进行ADME（ADMETlab 3.0）及毒性（Deep-PK）预测。
**研究结果**
**生物活性导向分离抗PTP1B成分**
通过活性追踪分离，从枣果实氯仿层中获得15种三萜化合物（1–15）。结构鉴定基于NMR波谱分析和文献比对。
**体外PTP1B抑制筛选**
化合物1–4、10和13显示出剂量依赖性PTP1B抑制活性，IC₅₀值为8.75–90.90 μM。其中，化合物2（IC₅₀ = 8.75 μM）活性最强，与阳性对照熊果酸（8.65 μM）相当；1和3也表现强抑制（17.02和11.06 μM）；10和13活性中等（60.92和53.42 μM）；4活性微弱（90.90 μM）；而5–15未显示抑制。
**体外α-葡萄糖苷酶抑制筛选**
基于PTP1B的结果，进一步测试化合物1–3对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。三者均表现出强抑制活性，IC₅₀值分别为7.02、6.75和7.06 μM，其中2活性略强。
**分子对接**
对接分析显示，化合物1–3与PTP1B和α-葡萄糖苷酶活性位点通过氢键、疏水和范德华力结合。对于PTP1B，结合能为-6.6至-7.4 kcal mol^-1；对于α-葡萄糖苷酶，结合能为-7.5至-8.2 kcal mol^-1，其中化合物2因额外的羟基与Gln1533形成氢键而结合最强。
**分子动力学**
100 ns MD模拟表明，PTP1B-配体复合物体系稳定，RMSD值波动小。结合自由能计算（MM/GBSA）显示化合物1–3的ΔG_bind分别为-19.30、-14.44和-13.93 kcal mol^-1，表明结合稳定。
**计算机ADME及毒性预测**
ADME预测显示化合物1–3符合Lipinski五规则，口服生物利用度良好。毒性预测提示三种化合物急性毒性较低（LD₅₀ > 2000 mg kg^-1），但存在潜在的致癌性和其他风险。
**讨论与结论**
研究结论为：本研究首次对越南枣果实中的五环三萜类化合物进行了全面的化学和生物活性研究，成功分离并表征了15个化合物。其中，白桦脂酸（1）、科罗索酸（2）和齐墩果酸（3）展现出强大的PTP1B和α-葡萄糖苷酶双重抑制活性，IC₅₀值均处于低微摩尔范围。这种双重靶点活性表明它们在通过互补机制调节葡萄糖稳态方面具有潜在的应用价值。分子对接和分子动力学模拟进一步证实，这些化合物能稳定地与两种酶活性位点的关键残基相互作用，主要涉及疏水接触、范德华力和有限的氢键。结构-活性关系分析强调了C-28羧酸和C-3羟基对酶抑制的重要性，而额外羟基取代基的位置及三萜骨架类型则显著影响结合亲和力和生物活性。此外，计算机ADME和毒性预测表明这些化合物具有良好的类药性、可接受的药代动力学特性和较低的急性毒性，支持其作为先导化合物。总体而言，这些发现为开发源自越南枣的五环三萜类化合物作为有价值的天然抗糖尿病药物来源提供了科学依据，值得进一步的体内研究和机制探讨以验证其治疗潜力。