《Journal of Hazardous Materials》：Single-Cell Screening of Indigenous Hydrocarbon-Degrading Bacteria for Efficient Controlling the Groundwater Hydrocarbon Pollution of Operating Industrial
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杨家文|赵伟涛|陈志辉|沈雷|林青燕|徐泽豪|潘千斌|杨家伟|沈超峰浙江大学环境与资源科学学院环境工程系，杭州，310058，中国摘要生物修复技术为处理地下水中的石油烃污染提供了有前景的方法。然而，传统的基于富集的分离方法存在一个关键瓶颈：虽然实验室验证的降解效率较高，但由于富集
杨家文|赵伟涛|陈志辉|沈雷|林青燕|徐泽豪|潘千斌|杨家伟|沈超峰
浙江大学环境与资源科学学院环境工程系，杭州，310058，中国
摘要
生物修复技术为处理地下水中的石油烃污染提供了有前景的方法。然而，传统的基于富集的分离方法存在一个关键瓶颈：虽然实验室验证的降解效率较高，但由于富集过程中的选择压力，实际应用效果较差。为了解决这个问题，本研究开发了一种基于单细胞筛选的新生物修复策略，替代了传统的富集分离方法，从而从受污染的地下水中获得能够降解烃类的本土细菌。通过省略富集步骤，筛选周期缩短至仅5天。此外，这种方法避免了人工培养基的选择压力，使得可以直接在原始地下水中分离出具有高生长和降解效率的本土菌株。在分离出的五个菌株中，Sphingobium yanoikuyae表现出最高的降解效率，在8天内将石油烃浓度从29.0±1.8 mg/L降低到3.6±1.6 mg/L（去除率87.6%）。在二维沙箱模型中，带有GFP标记的S. yanoikuyae迅速在系统中定殖，并在15天内形成了稳定的生物反应区，将烃类浓度从50 mg/L降低到20 mg/L。通过现场单次注入验证，确认在30天内成功定殖并建立了生物反应区，总石油烃浓度从48 mg/L降低到0.34 mg/L（去除率超过99%）。在1年的连续监测中未观察到尾效现象。这项工作建立了一种减少偏倚的筛选方法，弥合了实验室验证的降解效率与实际生物修复效果之间的长期差距。
引言
烃类污染是一个全球性的环境问题，对生态系统和人类健康构成严重威胁。由于受污染地下水系统的异质性和复杂性，烃类污染在地下环境中尤其具有挑战性[1]，[2]。目前，已经开发了多种方法来处理受烃类污染的地下水，包括抽提处理、多相萃取、原位化学氧化和渗透性反应屏障[3]。这些技术在修复废弃工业场地中的烃类污染方面取得了令人满意的效果。
近年来，中国对地下水管理的重点已从退役场地的修复转向运营中的工业设施的污染控制。然而，针对运营企业的有效控制技术仍然不完善，主要是因为现有结构和设备常常阻碍了对核心污染区域的钻探。这一限制使得抽提处理和多相萃取等技术无法完全清除关键区域的污染物，导致修复不完全和持续的尾效现象[4]，[5]，[6]。同样，原位反应屏障（PRB）的安装也受到空间限制。虽然可以通过上游注入井部分应用原位化学氧化，但这种方法会显著增加试剂消耗，并可能在氧化后引起二次污染。
在这种限制下，向地下水中注入功能性微生物以建立生物活性反应区是一种有前景的地下水修复策略[7]，[8]，[9]，[10]。该技术涉及将自然选择的微生物引入受污染的含水层，使其将烃类降解为无害物质。然而，在实现微生物在受污染地下水中的定殖和生长同时，尽量减少引入非本土微生物带来的生态风险方面仍存在关键挑战。从本土微生物中筛选高效的功能性菌株是解决受污染场地定殖不良和适应缓慢问题的可行方法[11]，[12]，[13]。传统的本土细菌筛选方法主要依赖于在选择性培养系统中富集微生物群落，然后通过平板划线分离。这种方法虽然获得了许多能够降解烃类的菌株，但最近的研究指出了其关键局限性[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19]。富集过程中施加的人工条件（如定义明确的培养基、固定温度和高底物浓度）会产生强烈的选择压力，有利于快速生长和耐营养的微生物。因此，获得的菌株可能最适合实验室环境，而不是最适用于原位修复的菌株[11]。Spini等人使用高通量测序技术证明，无论原始群落组成如何，富集培养最终都由少数几个属（如假单胞菌属）主导，证实了这种方法上的偏倚[16]。这种方法上的偏倚越来越被认为是实验室验证的降解效率与实际生物修复效果之间长期差距的主要原因之一——这是生物修复研究中的一个关键瓶颈[17]，[18]。
单细胞筛选是一种新兴的微生物分离技术，它在培养前将单个微生物细胞从环境样本中分离出来[20]，[21]。这种直接的单细胞分离策略消除了冗长的富集步骤，大大缩短了筛选时间并提高了通量。此外，它避免了富集过程中的种间竞争，使得能够选择适应原始地下水条件的功能性微生物。尽管单细胞筛选在从根际、海洋和土壤生态系统等各种环境中分离功能性微生物方面已被证明有效[22]，但其快速获得适用于地下水修复的降解烃类细菌的潜力仍需进一步研究。使用原始受污染地下水作为培养基的单细胞筛选方法可能成为快速获得高效修复细菌的有前景的方法。
因此，本研究旨在通过开发和验证一种快速的生物修复策略来填补这一知识空白，该策略结合了本土降解烃类细菌的单细胞筛选、大规模培养和原位注入，以建立有效的地下生物反应区。通过单细胞筛选，我们鉴定出了五种高效的降解烃类菌株，评估了它们的降解能力和对不同浓度烃类污染物的耐受性，并在二维沙箱模型和原位注入条件下研究了烃类降解细菌的分布和降解效果。我们的结果表明，这项技术可以有效控制运营企业地下水中的烃类污染。
章节摘录
石油烃降解细菌的单细胞筛选
图1展示了分离培养系统中单细胞接种的技术流程。用于分离降解烃类细菌的微生物样本取自实际受污染场地的地下水。获取地下水后，首先使用细胞计数板测量细胞数量，然后将地下水用0.22 μm聚醚砜膜过滤，稀释至约100个细胞/mL。使用20 mL注射器...
石油烃降解细菌的单细胞筛选
图1显示了运营工业场地地下水的细菌群落结构。主要属包括Sphingobium（21.4%）、Novosphingobium（17.4%）、Acidovorax（5.1%）、Sediminibacterium（5.6%）和Caulobacter（3.2%）。经过单细胞筛选并在96孔板中培养5天后，微孔的OD600值显著增加，表明相应的微孔中存在降解烃类的细菌。
DNA...
高效控制石油烃污染
在本研究中，使用单细胞筛选技术从受污染的地下水中筛选出了本土降解烃类的细菌S. yanoikuyae
结论
本研究表明，单细胞筛选是一种快速分离高效本土降解烃类细菌Sphingobium yanoikuyae的强大工具，从而克服了传统微生物修复方法中固有的定殖和适应缓慢的局限性。将这种筛选技术与后续培养和原位注入相结合，能够在模拟和实际环境中快速形成稳定且有效的生物反应区
环境影响
石油烃是工业场地中普遍存在的地下水污染物，对生态系统和人类健康构成长期风险。由于空间限制和尾效现象，传统修复方法在运营设施中常常失效。本研究提出了一种使用本土Sphingobium yanoikuyae的快速生物修复策略，该菌株是在环境相关条件下（实际地下水，TPH <50 mg/L）通过单细胞筛选分离得到的。现场应用实现了超过99%的去除率
CRediT作者贡献声明
沈超峰：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调。杨家伟：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法论设计、概念构思。潘千斌：方法论设计、数据管理。赵伟涛：数据可视化、方法论设计、数据管理。杨家文：初稿撰写、方法论设计、调查、数据管理。徐泽豪：数据可视化、数据管理。林青燕：资源协调、数据管理。沈雷：调查、数据管理。陈志辉：资源协调，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（42277007）、中国国家重点研发计划（2022YFC3702403）和浙江省重点研发计划（2023C03139）的支持。
