《Journal of Hospital Infection》：Establishment of a standardized Phase 2/Step 2 method for virucidal surface disinfection: Results of an interlaboratory ring trial (4-field test)
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摘要：评价表面消毒剂在含机械作用的实际条件下对病毒的灭活效力仍是一项重大挑战。现行标准主要依赖悬液试验（Suspension Test）和无机械作用的载体试验（Carrier Test），而含机械擦拭作用的表面病毒学方法尚未充分验证。本方法学验证研究报道了采用
摘要：评价表面消毒剂在含机械作用的实际条件下对病毒的灭活效力仍是一项重大挑战。现行标准主要依赖悬液试验（Suspension Test）和无机械作用的载体试验（Carrier Test），而含机械擦拭作用的表面病毒学方法尚未充分验证。本方法学验证研究报道了采用硬水进行病毒四区试验（4-field test）的室间环试（Interlaboratory Ring Trial）结果。目的是验证一种符合欧洲标准的实用测试方法，并为CEN TC216 WG1活动中新工作项目（Work Item）的制定提供支持。十三个欧洲及国际实验室在非多孔表面上，使用硬水对三种人类病原模型病毒——5型腺病毒（Adenovirus type 5, AV5）、安卡拉修饰痘苗病毒（Modified Vaccinia Virus Ankara, MVA）和小鼠诺如病毒（Murine Norovirus, MNV）——进行四区试验。评估了多个接触时间下的病毒回收情况，并按ISO 13528计算重复性（Repeatability）和重现性（Reproducibility）。结果显示所有病毒均可在测试区1（Test Field 1）被可靠回收。该方法在各实验室间总体稳健，尽管物理参数的变异会影响室间一致性，这凸显了机械驱动应用因素的相关性。结论：病毒灭活四区试验显示出作为Phase 2/Step 2方法的良好适用性，是未来纳入欧洲标准的有力候选方法。该方法特别适用于评价即用型湿巾（Ready-to-use Wipes, RTU Wipes），因其病毒灭活效果取决于擦拭材料、释放液体和机械作用的联合效应，与无机械作用时的结果可能存在显著差异。因此，采用模拟实际使用（Representative-of-use）的验证方法对于评估医院、长期护理机构及公共场所的消毒剂效力至关重要。
论文解读：病毒灭活四区试验（4-field test）作为表面消毒Phase 2/Step 2方法的方法学验证——室间环试结果总结
本研究发表于《Journal of Hospital Infection》。
一、研究背景与目的
环境中（尤其是医疗机构、养老院及公共场所）的表面可长期存活诺如病毒、腺病毒及痘病毒等临床相关病毒，构成间接传播风险。现行欧洲标准中，EN 14476悬液试验仅评价化学剂基础抗病毒谱，不含机械作用、蒸发及干燥动力学；现有表面试验如EN 16777（无机械作用）和EN 17111（器械浸泡再处理）均未模拟日常擦拭/拖拭消毒中含机械擦拭（Wiping/Mopping）的物理过程。而实际使用中，即用型湿巾（Ready-to-use Wipes, RTU Wipes）的灭活效果受擦拭材料清洁效应、浸渍消毒液释放量及机械摩擦共同影响，与悬液或无机械表面试验差异显著。CEN TC216已针对细菌（EN 16615）和芽孢（EN 17846）建立含机械作用的四区试验（4-field test, Phase 2/Step 2），但病毒学等效方法尚未经室间验证。为此，CEN TC216 WG1联合德国应用卫生协会（VAH）成立专题工作组，开展本室间环试（Interlaboratory Ring Trial），旨在验证改良病毒四区试验的可靠性、重复性及区分度，为制定新欧洲标准（Work Item 00216151）提供依据。
二、主要关键技术方法
2023年由CEN TC216 WG1组织德、欧、亚共13个实验室参与室间环试（一家因严重偏离方案被排除）。采用参照EN 16615修改的四区试验：于PVC板（FOREX classic, 20×50 cm）线性排列四个5×5 cm测试区（Test Field, TF1–TF4），仅TF1接种含干扰物质（洁净条件0.3 g/L BSA；脏污条件3 g/L BSA＋3 mL/L羊红细胞）的100 μL病毒悬液（模型病毒为Adenovirus type 5即AV5、Modified Vaccinia Virus Ankara即MVA、Murine Norovirus即MNV），晾干后用预浸16 mL硬水（Hard Water）的标准化擦拭布（Tork Standard Wipe）以约2.5 kg配重单向擦过TF1–TF4并折返，模拟机械擦拭。设定接触时间1、5、30、60 min后，用尼龙拭子（FloQSwab）从各TF回收病毒，通过细胞病变法（CPE）做终点稀释滴定，以Karber–Spearman法算lg TCID50/mL，按DIN EN ISO 13528计算重复性标准偏差（Repeatability sr）与重现性标准偏差（Reproducibility sR）。设初始病毒对照（VC）、干燥即刻对照（DC0）及对应接触时间干燥对照（DCt）、细胞毒性对照。全程仅用硬水不含活性化学消毒剂，以孤立评估方法与机械因素。
三、研究结果
病毒干燥过程中对照（Virus controls during desiccation）
比较干燥前（VC）与干燥后即刻（DC0）及延长时间（DCt）的病毒滴度。AV5与MNV干燥损失约1 lg，MVA损失较小（约0.5–1.0 lg），随时间延长DCt进一步下降。洁净与脏污条件趋势一致，脏污条件因有机物保护略减缓滴度降。各病毒VC至DC60均值变化在预期内，表明干燥致适度但可量化失活，初始TF1回收量足够支撑后续证明4 lg减少的要求。
测试区1（TF1）病毒回收（Virus recovery from test field 1）
TF1经擦拭及不同接触时间后的平均lg TCID50/mL随接触时间延长呈递减趋势（AV5清洁1 min均值3.73降至60 min 2.31；MNV清洁1 min 3.22降至2.25；MVA清洁1 min 2.88降至2.05；脏污条件相似）。AV5与MVA重复性sr多介于0.2–0.7，重现性sR多介于0.5–1.0；MNV重现性略宽（最高约1.32）。表明方法在实验室内一致性良好，室间变异在生物系统可接受范围，TF1可稳定回收足量病毒。
病毒由测试区2至4的转移（Virus transfer from test field 2 to 4）
擦拭后TF2–TF4可检出转移病毒，短接触时间（1–5 min）较明显，长接触时间（30–60 min）因病毒失活及回收限常检不出或极低。因病毒稳定性及检测限影响大，研究者认为不宜套用细菌试验的固定定量接受限，而应采用硬水对照（最差机械转移情形）作比较基准——产品试验中TF2–TF4病毒累积应低于或等同于硬水对照，以此评估交叉污染风险。
四、讨论与结论翻译
讨论指出，改良病毒四区试验填补了悬液试验及无机械表面试验无法反映擦拭消毒中机械移除、液体分布与再干燥交互作用的空白，所选三种代表病毒涵盖包膜/非包膜及不同抗性特征。干燥致病毒滴度下降具病毒特异性（MVA最耐干，AV5/MNV较敏感），有机物具保护作用，与既往报道相符。虽因依赖病毒－细胞培养双生物系统致室间变异略高于细菌/芽孢四区试验，但sR处于同类生物学环试预期可接受范围，低sr证实实验室内重复性好。个别离群z值归因于擦拭压力、布饱和度等物理参数微差，强调未来严格标准化必要性。转移现象证实擦拭可伴交叉污染，支持以硬水对照作相对比较而非固定阈值。本环试证实方法稳健、可重现，TF1对AV5、MVA、MNV均获可靠回收，具备作为Phase 2/Step 2病毒灭活表面擦拭测试基础的条件，适宜特别评价RTU Wipes，可作为未来CEN标准（WI 00216151）制定的科学依据；后续需在有活性消毒剂及不同施用方式下进一步验证。
原文结论翻译：病毒灭活四区试验（Virucidal 4-field test）证明是评估标准化洁净与脏污条件下表面病毒灭活效力的稳健且可重现之工具。其特殊意义在于评价以擦拭方式施用的表面消毒特别是即用型湿巾（RTU Wipes），其中机械作用、液体释放及干燥行为共同决定消毒表现。建立统一的病毒擦拭试验因此是现实产品评价的关键前提，并为适时制定相应欧洲标准（CEN WI 00216151）提供有力科学支撑。尽管观察到比杀细菌或杀芽孢应用更高程度的变异性（反映病毒学试验依赖双生物系统的固有复杂性），这凸显了进一步标准化的需求。未来应开展含消毒活性成分及其他擦拭施用方式（如喷洒、浸润）的室间环试，检验其在产品效力测试中的可行性与室间变异程度。
