《Nature Chemical Biology》：Structures of human telomerase with BIBR1532 reveal novel mechanism of inhibition
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人端粒酶(processively adds telomeric repeats, dGGTTAG)向染色体3′-末端添加端粒重复序列以维持端粒长度。端粒酶在大多数体细胞中缺失，但在大多数肿瘤细胞中异常上调以维持细胞永生化，使其成为颇具前景的肿瘤学靶点。然而迄
人端粒酶(processively adds telomeric repeats, dGGTTAG)向染色体3′-末端添加端粒重复序列以维持端粒长度。端粒酶在大多数体细胞中缺失，但在大多数肿瘤细胞中异常上调以维持细胞永生化，使其成为颇具前景的肿瘤学靶点。然而迄今为止尚无已报道的人端粒酶与抑制剂的复合物结构，阻碍了基于结构的药物设计与优化。研究人员报道了九套人端粒酶在有或无高选择性小分子端粒酶抑制剂BIBR1532存在下的冷冻电镜(cryo-EM)结构。出乎意料的是，BIBR1532结合于TERT finger与palm之间此前未知的口袋中。BIBR1532抑制端粒酶催化的每一步，但对端粒重复序列核苷酸添加限速第一步的抑制作用尤为显著。该结构揭示了一个刚性的finger结构域，解释了端粒酶催化速率慢及保真度低的原因。本研究揭示了端粒酶的催化机制及其被BIBR1532抑制的机制，解释了先前BIBR衍生物未能提高效力的原因，并为设计小分子端粒酶抑制剂提供了合理化途径。
《人端粒酶与BIBR1532复合物冷冻电镜结构揭示端粒酶催化机制及别构抑制新机理》论文解读
研究背景与意义
人端粒酶由端粒酶RNA(hTR/TER)、端粒酶逆转录酶(TERT)、组蛋白H2A/H2B二聚体及H/ACA核糖核蛋白颗粒组成，通过在染色体末端添加端粒重复序列(dGGTTAG)来维持端粒长度。端粒酶在体细胞中通常不表达，而在约90%的人类恶性肿瘤中异常高表达，是重要的抗癌药物靶点。虽然已有寡核苷酸类抑制剂（如已获FDA批准的imetelstat）及小分子抑制剂BIBR1532等被开发，但BIBR1532因体外IC50~100 nM、细胞内~1 μM及生物利用度差限制了其治疗应用。更重要的是，此前仅有进化距离较远的赤拟谷盗(Tribolium castaneum) TERT(TcTERT)与BIBR1532的晶体结构，推测其结合于人TERT C端延伸(CTE)域，以此模型进行的构效关系(SAR)改造均未获得优于原药的衍生物。此外，人端粒酶催化全循环的结构、其特有的慢速和低保真度催化特性的结构基础，以及BIBR1532确切的抑制机制均不明确。本研究在《Nature Chemical Biology》发表，利用冷冻电镜解析人端粒酶催化核心RNP结合BIBR1532及不同催化步骤的结构，旨在阐明BIBR1532真实结合位点与抑制机理，并揭示人端粒酶独特的催化动力学结构基础。
主要关键技术方法
研究人员采用HEK 293T细胞共表达带ZZ标签和Strep标签的人TERT及hTR进行人端粒酶全酶体内重组装与多步亲和纯化（IgG、链霉亲和素、MagStrep XT3）；制备含不同DNA引物（d(TTAGGG)3、d(TTAGGG)3TTAG、d(GGTTAG)3）、有/无BIBR1532及有/无非水解性dNTP类似物（dTpNHpp或dGpNHpp）的端粒酶–TPP1 OB域复合物样品；利用300 kV Titan Krios电镜采集数据，经cryoSPARC进行颗粒挑选、2D/3D分类及非均匀精修，并对首步加核苷酸状态样品以模板–引物双链区为中心做无对齐聚焦3D分类分离异质构象；使用Coot手动搭建模型、PHENIX与ISOLDE进行实空间精修；通过定点突变结合直接端粒酶活性测定（放射性标记dGTP延伸及5′-末端标记引物/ddNTP单步延伸实验）验证结合口袋残基功能及BIBR1532对各步核苷酸添加的抑制效应。
研究结果
Identification of the BIBR1532-binding pocket on telomerase（人端粒酶BIBR1532结合口袋的鉴定）
研究人员解析了结合d(TTAGGG)3引物、TPP1及BIBR1532的人端粒酶催化核心RNP 3.1 ?冷冻电镜结构。发现BIBR1532并未结合于此前推测的CTE域，而是结合在TERT逆转录酶(RT)域的finger（由基序1–2形成的β发夹）与palm之间的全新口袋内，距活性中心约12 ?，距RNA模板约6 ?。该口袋由finger(L617, M636)、基序3(V658)、基序B(H816)、基序B环(G830, Q827, S835)、IFD-C(F812)等残基构成疏水表面并通过S835与BIBR1532羧基形成氢键。BIBR1532结合引起H816翻转堆叠萘环及L617侧链偏移约30°，但不改变催化腔整体结构及模板–DNA引物4 bp双链。丙氨酸扫描显示口袋关键残基（除V658A、M636A外）突变显著降低端粒酶活性；突变后BIBR1532抑制效应下降（IC50升高至259–1320 nM vs WT 67 nM），证实该口袋为真结合位点。此口袋主要由端粒酶特异基序构成且在Tetrahymena或TcTERT中不保守，解释了BIBR1532对人端粒酶的高度特异性。
Features of the BIBR-binding pocket（BIBR结合口袋的特征）
BIBR结合口袋一侧由finger(β12, β13)与基序B(β18, β19)及TRBD(β11)组成的五链β折叠构成，另一侧由基序B环环绕。口袋残基参与维持一个与催化相关的相互作用网络——基序B环P832-Q827互作并连接核苷酸结合口袋内的Q833；S835与模板核苷酸C50形成vdW作用并与IFD-C F812互作；基序B H816与finger L617有vdW接触。该网络对端粒酶催化至关重要，解释了为何破坏此网络的丙氨酸突变（除不参与该网络的V658A、M636A）会削弱酶活性。
Telomerase TERT has a unique rigid finger（人TERT具有独特的刚性finger结构域）
为探究BIBR1532是否影响核苷酸添加时的构象变化，研究人员解析了结合非水解dTpNHpp的三元复合物(T3D2+)结构(2.9 ?)。与典型DNA聚合酶finger域在dNTP结合时发生大幅(open→closed)构象变化(可达11 ?)不同，人TERT finger在有无dNTP及有无BIBR1532时位移均<1 ?。结构显示TERT finger被TERT特异的TRBD（含T-motif、α14、α20）像分子"钳"一样固定——T-motif F586–finger P627、α14 L448–finger I624、α20 I590–finger F623及α20 H592–finger P632形成疏水作用，T-motif T567与finger P625骨架形成氢键。该钳制作用阻止了finger闭合，使dNTP结合口袋维持在介于HIV-1 RT open与closed之间的中间状态。
Rigid finger explains telomerase high error and slow rate（刚性finger解释端粒酶高错误率与慢催化速率）
尽管finger主链刚性，dNTP结合时仍观察到finger上R631、palm上Q833重排以稳定dNTP磷酸基团，以及Y717旋转发挥立体门控排除rNTP。缺乏finger大尺度开合运动使端粒酶依赖局部侧链重排完成催化，这与典型高保真DNA聚合酶不同。类比Y族DNA聚合酶具固有非动态finger导致慢速与低保真，人端粒酶被TRBD钳制的刚性finger从结构上解释了其较慢的催化速率(约比典型聚合酶慢)及较低保真度(错误率~2×10?3/nt)。
BIBR1532 disproportionately inhibits the first nucleotide addition（BIBR1532选择性抑制限速的第一步核苷酸添加）
单步延伸实验(使用5′-32P标记引物与ddNTP)显示BIBR1532对端粒重复合成六步中多数步仅有10–20%抑制，但对第一步核苷酸添加抑制达~60%。该步已被报道为人端粒重复合成的限速步。为探明结构基础，研究人员解析了模板定位步(T0D0，5 bp双链，末bp在活性位点)及第一步加dGpNHpp(T1D0+)的有/无BIBR1532结构(2.7–3.0 ?)。发现无dNTP时引物形成5 bp(T0D0)；加dGpNHpp后双链移位为4 bp且dGpNHpp配对于活性位点(T1D0+)，证实首步需额外双链易位(T0D0→T1D0)使dNTP进入，此为限速亚步骤。BIBR1532存在下T1D0+样品经3D分类得到三类：I类(T1D0+，~42%)、II类(异常'T0D0'中间态，引物3′端倾斜配对不完整，~29%)、III类(T1D0无dNTP密度，~29%)，表明BIBR1532阻碍T0D0→T1D0的核苷酸易位，尤其影响本就较慢的首步易位。
Mechanism of inhibition by BIBR1532（BIBR1532的抑制机制）
综合结构及功能数据，研究人员提出BIBR1532为别构抑制剂：其结合于finger–palm间口袋，不直接干扰核苷酸结合或催化残基，也不改变TERT–模板互作，但通过占据该口袋阻尼了由五链β折叠与基序B环构成的官能单元所需的协调运动，该运动对每次核苷酸添加后模板–DNA双链逐步易位是必需的。BIBR1532因此别构抑制核苷酸易位(nucleotide translocation)，尤其显著抑制无无机焦磷酸(PPi)释放驱动、依赖双链自发涨落的首步易位，从而 disproportionately抑制限速首步，降低端粒酶重复添加进程性(RAP)。
讨论与结论（总结翻译）
本研究呈现了人端粒酶催化核心RNP在端粒重复合成循环中两个步骤、有/无dNTP类似物及有/无BIBR1532的九套冷冻电镜结构(2.7–3.4 ?)。这些结构揭示BIBR1532结合于RT域finger与palm间的全新口袋，并发现人TERT具被TRBD钳制的独特刚性finger，解释了端粒酶慢速与低保真特性。BIBR1532通过别构抑制模板–DNA双链易位（尤限速首步）发挥抑制，而非靶向finger闭合运动。该真人源结构解释了以往基于TcTERT模型的BIBR衍生物优化失败的原因（如BIBR1591在人TERT口袋中产生空间冲突），也为基于真人端粒酶结构进行BIBR系列小分子抑制剂理性设计提供了新起点。
