《Materials Today Bio》：A tetrahedral framework DNA-based bioswitchable miR-26a-5p delivery system for idiopathic pulmonary fibrosis
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特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种进行性且最终致命的间质性肺病，目前治疗选择极为有限。MicroRNA尤其是miR-26a-5p在临床前研究中显示出强效的抗纤维化作用，但其临床转化一直受到生理环境中
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特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种进行性且最终致命的间质性肺病，目前治疗选择极为有限。MicroRNA尤其是miR-26a-5p在临床前研究中显示出强效的抗纤维化作用，但其临床转化一直受到生理环境中固有的酶降解敏感性和细胞摄取效率低的阻碍。在本研究中，研究人员开发了一种基于四面体框架核酸的生物可切换miRNA递送系统，称为BiRDS26，用于miR-26a-5p的靶向递送。BiRDS26在体外和体内模型中均表现出强大的抗纤维化活性，其机制是通过协调抑制Hippo和Wnt信号通路介导的。总之，这些结果将BiRDS26定位为一个合理设计的纳米治疗平台，具有显著的IPF治疗转化潜力。
论文解读：
特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF）是一种慢性、进行性的间质性肺疾病，其病理特征包括肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞异常激活、细胞外基质过度沉积以及组织刚度增加，最终导致肺功能不可逆下降。尽管美国食品药品监督管理局已批准吡非尼酮和尼达尼布用于临床治疗，但这些药物仅能延缓肺功能下降，无法逆转已有的纤维化病变，且常伴有胃肠道不适等显著副作用。因此，开发新型、安全、有效的非侵入性治疗手段，特别是针对早期IPF的干预策略，具有迫切的临床需求。近年来，以微小RNA（microRNA, miRNA）为核心的非编码RNA疗法展现出巨大潜力。miRNA可通过序列特异性结合靶标信使RNA，实现转录后基因沉默或翻译抑制，从而广泛调控细胞增殖、分化、凋亡及病理重塑等关键过程。然而，miRNA疗法的临床转化面临固有核酸酶敏感性、药代动力学不佳、细胞摄取效率低以及难以跨越肺泡-上皮屏障等核心挑战。为克服这些限制，先进核酸递送平台成为纳米治疗学发展的重点。四面体DNA纳米结构（Tetrahedral DNA Nanostructures, TDN）凭借其优异的生物相容性、高产率、高热力学/动力学稳定性、机械稳健性及易于功能化等特点，成为一种极具前景的基因递送载体。然而，传统TDN-miRNA偶联物常因miRNA序列部分暴露而易受核酸酶切割，且结构增大可能阻碍其穿越组织屏障并降低细胞摄取效率。此外，静脉给药的TDN易在肝、肾蓄积，肺靶向性不足。基于此，本研究旨在设计一种基于TDN的新型生物可切换miRNA递送系统，即BiRDS（Biologically Switchable miRNA Delivery System），以实现miR-26a-5p的高效、稳定及肺靶向递送，并评估其在IPF治疗中的效果与机制。该研究发表于《Materials Today Bio》。
为开展此项研究，研究人员采用了多项关键技术方法。首先，通过分析公共基因表达数据集（GSE45789、GSE32538）筛选IPF中差异表达的miRNA，并利用生物信息学工具预测miR-26a-5p的靶基因及富集信号通路。其次，采用一锅法自组装技术合成BiRDS26，并通过琼脂糖凝胶电泳、动态光散射、原子力显微镜和透射电子显微镜对其进行理化表征。在体外实验中，利用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术评估细胞摄取效率，采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色分析EMT和纤维化标志物。在体内实验中，建立博来霉素诱导的慢性多剂量小鼠IPF模型，通过气道滴注给予治疗，利用活体成像系统评估生物分布，通过显微CT和组织学染色评估治疗效果，并检测血清生化指标以评价安全性。最后，整合单细胞RNA测序数据分析IPF患者肺组织中的细胞类型与通路活性，并通过蛋白质印迹和免疫荧光验证关键信号分子的表达变化。
研究结果部分如下：
2.1. Design, preparation, and characterization of BiRDS26
研究人员通过分析GEO数据集，鉴定出miR-26a-5p是IPF中显著下调的候选miRNA。随后成功构建了BiRDS26，其结构包含三条单链DNA构成的“太阳核心”及三条包裹其中的miR-26a-5p“不死鸟”。表征结果显示，BiRDS26呈约10 nm的等边三角形纳米颗粒，水动力直径为8.66 ± 3.04 nm，ζ电位为-7.36 ± 8.19 mV。稳定性测试表明，BiRDS26在含血清培养基、室温储存及模拟肺泡液环境中均表现出优异的抗降解能力，并能抵抗RNase H的切割，证实了其作为核酸药物的强大保护潜力。
2.2. Cellular uptake of BiRDS26
细胞实验显示，与游离miR-26a-5p相比，BiRDS26能被人肺泡上皮细胞（A549）和人胚肺成纤维细胞（MRC-5）高效内化。流式细胞术定量分析表明，孵育12小时后，超过90%的细胞摄入了Cy5标记的BiRDS26。此外，CCK-8和活/死细胞染色实验证实，BiRDS26具有良好的生物相容性，且在有效浓度下对细胞增殖无抑制作用，无明显细胞毒性。
2.3. BiRDS26 suppresses fibroblast activation and EMT in epithelial cells
在博来霉素诱导的细胞纤维化模型中，研究人员发现BiRDS26能显著抑制上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）和成纤维细胞活化。具体而言，BiRDS26处理上调了上皮细胞标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）的表达，同时下调了间质细胞标志物波形蛋白（vimentin）以及纤维化标志物纤连蛋白（fibronectin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。这表明BiRDS26可通过双重机制发挥抗纤维化作用。
2.4. BiRDS26 suppresses fibroblast activation and EMT in epithelial cells through modulation of the Hippo and Wnt signaling pathways
为探究其分子机制，研究人员整合多个数据库预测到57个高置信度的miR-26a-5p靶基因，KEGG通路富集分析指出Wnt和Hippo信号通路是关键。对公开单细胞数据集（GSE135893）的分析进一步证实，在IPF患者的上皮细胞中Wnt信号激活，在成纤维细胞中Hippo信号激活。实验验证表明，BiRDS26能以剂量依赖方式显著降低Hippo通路效应因子CTGF和Wnt配体Wnt5a的蛋白水平，从而协同抑制这两条促纤维化轴。
2.5. Safety and efficacy of BiRDS26 in vivo
体内生物分布研究显示，经气道滴注后，Cy5标记的BiRDS26在肺部的荧光强度显著高于游离miR-26a-5p及其他器官，实现了高效的肺靶向蓄积。在慢性多剂量博来霉素IPF小鼠模型中，BiRDS26治疗将小鼠生存率从40%（模型组）提高至80%，并促进了体重的恢复。组织病理学分析和血清生化检测均未发现明显的心、肝、脾、肾毒性，证实了其在治疗剂量下的良好安全性。
2.6. Therapeutic benefits of BiRDS26 in BLM-induced pulmonary fibrosis in vivo
显微CT三维重建显示，BiRDS26治疗显著改善了博来霉素引起的肺容积减少和结构破坏。组织学评估（H&E和Masson三色染色）表明，BiRDS26能有效减轻肺泡损伤、炎症细胞浸润和胶原沉积，Ashcroft评分显著改善。蛋白质水平分析进一步证实，BiRDS26在体内同样能抑制EMT和成纤维细胞活化标志物的表达。
2.7. BiRDS26 suppresses fibroblast activation and EMT in epithelial cells in vivo through modulation of the Hippo and Wnt signaling pathways
最后，研究人员在体内验证了BiRDS26的作用机制。蛋白质印迹和免疫荧光结果一致显示，BiRDS26处理能显著降低纤维化肺组织中CTGF和Wnt5a的表达。此外，研究还发现BiRDS26能抑制TGF-β1/SMAD通路的激活，表明其抗纤维化作用具有多通路协同调控的特点。
总结讨论部分：
本研究成功开发了一种名为BiRDS26的新型四面体框架核酸基生物可切换miRNA递送系统，用于治疗特发性肺纤维化。该系统通过一锅法自组装，能将miR-26a-5p完全封装于纳米结构内部，从而赋予其卓越的血清稳定性、抗核酸酶能力以及高效的细胞摄取率。与传统的TDN载体相比，BiRDS26不仅合成简便、结构均一（约10 nm），还能通过气道滴注实现肺部特异性蓄积，最大限度减少了全身暴露和脱靶效应。在博来霉素诱导的IPF小鼠模型中，BiRDS26表现出了强大的治疗效果，能显著提高动物生存率，改善肺功能，减轻肺组织胶原沉积和病理损伤，且未观察到明显的系统性毒性。从机制上看，BiRDS26所载的miR-26a-5p通过协同抑制Hippo信号效应因子CTGF和Wnt信号配体Wnt5a，进而阻断了成纤维细胞的异常活化和肺泡上皮细胞的EMT过程。此外，该系统还对TGF-β1/SMAD通路具有抑制作用，体现了多靶点调控的优势。结论部分指出，BiRDS26是一个具有临床转化潜力的、可通过气道给药的miRNA治疗平台。它不仅能选择性抑制CTGF和Wnt5a驱动的纤维化信号，其优异的药代动力学、药效学和安全性特征，使其有望成为IPF乃至其他与miRNA失调相关疾病的新一代治疗策略。未来的研究将致力于进一步优化其结构活性，以提高肺靶向性和胞内释放效率，并探索其与现有抗纤维化药物（如吡非尼酮）联合应用的协同疗效。
