肠道微生物通过β-葡萄糖醛酸酶重新激活宿主雄激素以调控肠道运动性

《Nature Neuroscience》：Microbial reactivation of host androgens directs enteric neuronal regulation of gut motility

　　

肠道内容的协调转运对于消化和宿主防御至关重要，受神经环路、肠道肌肉壁和腔内因素之间串扰的调控。在此研究中，研究人员表明，雄激素信号传导至Nos1+肠神经元（ENS）和Scn10a+脊髓传入神经元对于小鼠正常的肠道转运是必需的，且该过程依赖于微生物组。使用抗生素进行微生物耗竭会消除肠神经元中的雄激素受体表达，降低血清睾酮水平，并导致运动功能障碍。雄激素是抗生素影响转运所必需的，并且在一定程度上足以挽救运动功能障碍。Nos1神经元在青春期期间上调雄激素受体，这与粪便细菌β-葡萄糖醛酸酶（GUS）活性的变化平行，该酶在小鼠和人类中均可解离类固醇葡萄糖醛酸苷。发现代谢雄激素葡萄糖醛酸苷的GUS酶的结肠内给药足以在微生物耗竭的小鼠中恢复神经元雄激素信号。因此，肠道微生物通过GUS酶重新激活宿主排泄的雄激素，代表了一种动态的微生物-宿主相互作用，对于稳态下的外周神经系统功能至关重要。

肠道内容的定向移动从摄入到排出对生命至关重要。肠道运动活动由肠神经系统（ENS） directing，ENS是构成消化道固有神经系统的复杂神经胶质网络。肠道细菌可以通过产生向ENS发出信号的因子来影响胃肠道（GI）运动，例如芳基烃受体配体和胆汁酸代谢物1,2,3,4,5。在无菌条件下饲养的无菌小鼠1,2,4或在常规饲养条件下暴露于广谱抗生素（ABX）的小鼠6,7均表现出肠道转运减慢。然而，迄今为止发现的微生物衍生因子均未完全挽救这些小鼠中的缺陷，表明仍有其他因素有待发现。研究人员此前报道，性腺雄激素向ENS中的神经元发出信号，选择性调节结肠的推进性运动行为8。雄激素是类固醇激素，如睾酮，其在青春期后的男性中比女性循环水平更高。睾酮还原为二氢睾酮（DHT），这是一种强效的雄激素受体（AR）配体，与睾酮不同，DHT不能芳香化为雌二醇9。AR是一种核激素受体，以配体依赖的方式调节基因表达10。在大脑中，AR信号传导在介导性二态行为（如交配、攻击和求偶）的环路中发挥关键作用11。在外周神经系统中，雄激素信号在性功能之外的作用相对未被充分探索。ENS中雄激素的细胞靶点以及该通路为何特异性调节结肠运动活动仍不清楚。

研究人员开展了以下主要研究，并得出以下结论，具有重要的科学意义，论文发表在《Nature Neuroscience》：

**研究背景与问题**
肠道运动行为沿胃肠道在神经调节的多样性、复杂性和程度上各不相同36,37。研究人员此前发现，性腺雄激素特异性地要求结肠运动功能8。多种非神经和神经细胞类型参与结肠运动并表达AR，但仅在Nav1.8+或Nos1+神经元中进行条件性删除足以使转运减慢。在AR+细胞中，几乎所有AR+细胞均为Nos1+运动神经元，这些神经元以受控方式抑制平滑肌收缩以支持推进活动。AR表达在大鼠、小鼠和人类中在结肠中显著高于血清水平24,38，这促使假设ENS响应这一局部配体来源。结肠中的睾酮和DHT水平在无菌小鼠中较低，表明微生物参与其产生24。确立移植肠道微生物或粪便到无菌或常规饲养小鼠体内可以改变小鼠体内血清睾酮水平的研究13,14，但数据在微生物是否对正常系统性雄激素水平至关重要方面存在冲突13,14,24,39。研究人员旨在确定结肠中介导雄激素对肠道运动影响的细胞，并确定该信号是否受细菌活动调节，代表一种影响神经系统功能的宿主-微生物相互作用。

**主要技术与方法**
研究人员使用了多种关键技术方法，包括：1. 利用特定遗传背景（CD1野生型及C57BL/6背景下的条件性敲除小鼠，如Nos1CreER/+, PDGFRaCreERT2/+, SM22aCreERT2/+, Nav1.8Cre/+与Arfl/fl交配）构建AR条件性敲除（KO）小鼠，以特异性删除特定细胞类型（如Nos1+神经元、Nav1.8+神经元、SMCs、PDGFRα+细胞）中的AR。2. 使用广谱抗生素（ABX）方案对小鼠进行微生物耗竭处理。3. 进行胃肠道转运时间（GITT）测定和自发粪便输出（FPO）分析以评估运动功能。4. 利用免疫组织化学和共聚焦显微镜技术检测AR、NOS1等蛋白在结肠组织、背根神经节（DRG）中的表达定位。5. 进行鸟枪法宏基因组测序，分析小鼠和人类粪便样本中微生物群落的分类和功能潜力，特别是针对GUS基因的丰度分析。6. 体外酶活性测定，使用重组大肠杆菌GUS代谢睾酮和DHT葡萄糖醛酸苷，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）定量产物。研究使用的样本队列包括成年和青春期前CD1雄性小鼠，以及来自公共数据库的506名健康男性（3-9岁和18-24岁）的粪便宏基因组样本。

**研究结果**

**Androgen signaling to the colonic neuromuscular circuit（雄激素信号传导至结肠神经肌肉环路）**
研究人员通过免疫组织化学表征成年野生型CD1小鼠结肠中AR的表达。发现SIP合胞体（平滑肌细胞、Cajal间质细胞和PDGFRα+成纤维样细胞）中的大多数AR+细胞为PDGFRα+细胞。ENS中AR表达具有区域差异性，远端结肠最高。在雄性小鼠中，结肠肠神经元仅在青春期后表达AR，且几乎所有AR+肠神经元均表达NOS1（神经源性一氧化氮合成酶1），表明雄激素信号局限于蠕动反射环路的抑制性臂。通过使用Cre重组酶系统生成针对特定细胞类型的AR条件性敲除小鼠，发现仅在Nav1.8+传入神经元或Nos1+肠神经元中缺失AR会导致肠道转运时间延长约33%，而缺失平滑肌细胞或PDGFRα+细胞中的AR则无此影响。体外结肠运动性分析显示，ARNOS1KO小鼠表现出类似于去势（ORCH）小鼠的舒张缺陷，表明雄激素信号对于Nos1+神经元的正常舒张功能至关重要。

**Microorganisms dynamically affect host androgens（微生物动态影响宿主雄激素）**
研究人员通过7天的广谱抗生素（ABX）处理耗竭小鼠肠道微生物。结果显示，ABX处理显著减慢了胃肠道转运，降低了自发粪便输出，并导致血清睾酮水平急剧下降及精囊萎缩。同时，ABX小鼠肠神经元和非神经元细胞中的AR表达几乎完全消失。尽管长期（28天）ABX处理后宿主通过补偿机制恢复了系统性睾酮水平，但肠神经元中的AR表达并未恢复，且肠道转运依然缓慢。这表明肠道微生物动态调节宿主雄激素水平，且ENS对雄激素耗竭特别敏感。

**Androgens mediate microbial regulation of GI motility（雄激素介导微生物对GI运动性的调节）**
为了验证雄激素在微生物调节肠道运动中的作用，研究人员在青春期前小鼠和去势（ORCH）小鼠中进行ABX处理。结果显示，在低雄激素水平的青春期前小鼠和ORCH小鼠中，ABX对肠道转运无影响，而在假手术（SHAM）小鼠中则显著减慢转运。此外，在ABX处理的成年雄性小鼠中植入释放DHT的缓释颗粒，部分恢复了肠道转运时间和AR表达。这表明循环雄激素水平的充足是微生物影响成年雄性肠道运动的必要条件，且全身补充DHT足以部分挽救因微生物耗竭引起的运动功能障碍。

**Microbial GUS activity regulates androgen signaling in the ENS（微生物GUS活性调节ENS中的雄激素信号）**
研究人员通过鸟枪法宏基因组测序分析粪便样本，发现小鼠和人类青春期后，微生物组的功能潜力发生显著变化，特别是GUS基因的丰度增加。GUS酶能够裂解类固醇葡萄糖醛酸苷，重新生成游离类固醇。体外实验证实，重组大肠杆菌GUS能有效代谢睾酮和DHT葡萄糖醛酸苷。在ABX小鼠结肠内给予活性大肠杆菌GUS，而非活性对照，足以恢复肠神经元中AR和NOS1的表达，即使此时血清睾酮水平仍然低下。这证实了局部微生物GUS活性对于恢复ENS中的雄激素信号至关重要，且ENS依赖于局部的微生物雄激素再活化，而非仅依赖系统性循环。遗传标记实验进一步表明，微生物耗竭并不导致NOS1神经元死亡，而是下调其NOS1蛋白表达，补充雄激素或GUS后可恢复表达。

**讨论与结论**
综上所述，研究人员表明，涉及雄激素代谢的动态双向宿主-微生物相互作用对于神经调控肠道运动性至关重要。排泄到肠道腔内的非活性宿主雄激素葡萄糖醛酸苷成为微生物GUS酶的底物，GUS酶裂解葡萄糖醛酸基团，产生 potent 的活性雄激素库。这些重新激活的雄激素向肠神经元发出信号以刺激运动，并被重新吸收到体循环中。回收的雄激素占宿主循环水平的很大一部分，因此短期广谱抗生素导致的微生物破坏会引起症状性性腺功能减退。虽然宿主最终通过补偿机制恢复了系统性睾酮水平，但这不足以恢复结肠ENS中的AR表达或正常化肠道运动，表明ENS特别依赖于结肠局部的雄激素产生。相反，粪便微生物GUS组成在小鼠和人类青春期发生变化，富集一种能有效重新激活雄激素的GUS。这项研究揭示了肠道微生物通过GUS酶重新激活宿主雄激素，进而调控肠神经系统中Nos1+神经元和Nav1.8+传入神经元，从而维持正常肠道运动性的新机制，为理解微生物-宿主互作在神经功能中的作用提供了新视角。