靶向叉头框蛋白M1(FOXM1)的特异性T细胞受体(TCR)工程化T细胞杀伤非小细胞肺癌

《Cancer Immunology Research》：FOXM1-Specific TCR-Engineered T Cells Target Non–Small Cell Lung Cancer Open Access

　　

摘要：叉头框蛋白M1(Forkhead box protein M1, FOXM1)在多种癌症中高表达，被认为是癌症进展的关键驱动因子。据此，研究人员评估了FOXM1的免疫原性，并探讨利用T细胞受体(T cell receptor, TCR)工程技术靶向该转录因子的可行性。研究人员鉴定出源自FOXM1、在HLA-A02:01、HLA-A24:02及HLA-A*23:01上具免疫原性、经内源性加工提呈并可诱导T细胞活化及细胞毒性T细胞应答的表位。制备TCR工程化T(TCR-T)细胞后，分别通过多肽剂量-反应实验和氨基酸残基扫描(X-scan)确认了其敏感性与特异性。最重要的是，在荷瘤免疫缺陷小鼠模型中，过继转移TCR工程化T细胞可显著抑制肿瘤生长并明显延长生存期。本研究证实了FOXM1的免疫原性及利用TCR工程化技术靶向该抗原的可行性。

论文解读：靶向FOXM1的特异性TCR-T细胞治疗非小细胞肺癌的研究

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌总数约85%，尽管免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)及酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的应用改善了部分晚期患者的预后，但获得性耐药及初始无响应仍普遍存在，长期疗效有限。TCR工程化T(TCR-engineered T, TCR-T)细胞疗法可靶向肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)或新抗原(neoantigen)，其中TAA因在患者群体间共享而具更广的临床适用性。叉头框蛋白M1(Forkhead box protein M1, FOXM1)是调控细胞周期的关键转录因子，在NSCLC等多种实体瘤中高表达并促进增殖、侵袭及上皮-间质转化，且与不良预后相关，但在正常成人组织中表达极低，是潜在的TAA靶标。此前FOXM1来源多肽主要被用于疫苗研究且临床疗效有限，尚未见针对NSCLC开展FOXM1特异性TCR克隆及TCR-T功能验证的系统性研究。本研究由MD Anderson癌症中心团队发表于《Cancer Immunology Research》，旨在鉴定FOXM1来源HLA-I类分子限制性免疫原性表位，分离鉴定高亲和力TCR αβ配对，构建TCR-T细胞并系统评估其在体外的杀伤敏感性、特异性、脱靶毒性及在NSG小鼠模型中的体内抑瘤与生存获益。

主要关键技术方法：

研究人员利用NetMHCpan4.1预测结合高流行率HLA-I类等位体的FOXM1源9肽表位；采用树突状细胞(dendritic cell, DC)脉冲多肽刺激健康供体外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)富集抗原特异性CD8⁺T细胞并经四聚体(tetramer)分选；通过10x Genomics单细胞5′基因表达与V(D)J测序鉴定优势TCR αβ链克隆型并克隆至逆转录病毒载体pMSGV1；采用反转录病毒转导静息/活化CD8⁺T细胞制备TCR-T细胞并经二次分选与快速扩增协议(rapid expansion protocol, REP)扩增至足量；通过免疫肽组学(immunopeptidomics, LC-MS/MS)验证内源性加工提呈；以⁵¹Cr释放法测细胞毒、ELISPOT及MIP-1β ELISA测细胞因子分泌、多肽滴定及丙氨酸扫描(X-scan)评估敏感性/特异性；以Western blot检测FOXM1在正常组织原代细胞系与肿瘤细胞系的蛋白水平；利用TCGA与GTEx数据库比对FOXM1在NSCLC与正常组织的mRNA表达；在NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下移植H1975 FOXM1(HLA-A*02:01⁺)细胞建立荷瘤模型，尾静脉过继输注TCR-T1细胞并联合IL-15/IL-15Rα复合物支持，监测肿瘤体积、体重及生存；利用GLIPH2算法分析MD Anderson ICON(n=104)与PROSPECT(n=275) NSCLC患者TCR库中与FOXM1 TCR相关的克隆型。

研究结果

FOXM1 is prevalent in lung cancer and minimally expressed in healthy organs and tissues

分析TCGA肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD, n=517)、肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC, n=501)与GTEx多器官正常组织发现，NSCLC中FOXM1 mRNA平均表达(LUAD 22.49 TPM, LUSC 56.62 TPM)显著高于所有实质器官(均值4.04 TPM，均低于5 TPM阳性阈值；脑0.79、心脏0.71、肾脏2.07、肝脏1.88、肺4.99，P<0.0001)。81% LUAD与99% LUSC为FOXM1阳性，而99%心脏、100%脑、95%肝、96%肾及77%肺组织不表达或低于阈值。Human Protein Atlas及Western blot证实正常原代细胞系(心肌AC16、脑AST-1、肝HC3716-hTert、肾上皮HEK-293、支气管上皮HBEC3-KT)FOXM1蛋白低/不表达，NSCLC细胞系高表达。对9株NSCLC细胞行IFNγ诱导免疫肽组学，2/3细胞系可内源性提呈FOXM1衍生表位于不同HLA-I类分子，证实其可作为HLA限制性TAA。

FOXM1 is immunogenic on HLA-A02:01 and HLA-A24:02**

经NetMHCpan4.1筛选，锁定FOXM1_465–473(YLVPIQFPV, 结合HLA-A02:01)与FOXM1_616–624(IYTWIEDHF, 结合HLA-A24:02/A23:01)。用对应多肽刺激HLA匹配健康供体PBMC后可检测到0.04%–0.4% tetramer⁺CD8⁺T细胞，REP扩增后达6.9%–21.3%。经⁵¹Cr释放实验，抗原特异性T细胞在10:1效靶比下可裂解多肽脉冲靶细胞(HLA-A02:01 69%、A24:02 86%、A23:01 53%)及内源性FOXM1/HLA表达肿瘤细胞(P≤0.0382)，证实两表位具免疫原性且在NSCLC细胞中经内源性加工与HLA I类分子提呈。

TCR-T cells exhibit cytotoxic potential against FOXM1-expressing targets

对tetramer分选T细胞行单细胞TCR/RNA测序获4个优势克隆：TCR-T1(HLA-A02:01–YLVPIQFPV, TCRβ CASSYAGPGELFF)、TCR-T2/TCR-T3(HLA-A24:02–IYTWIEDHF)、TCR-T4(HLA-A*23:01–IYTWIEDHF)。逆转录病毒转导制备TCR-T细胞后，10:1效靶比⁵¹Cr释放显示TCR-T1–TCR-T4分别裂解25%、31%、62%、31% FOXM1/HLA匹配靶细胞(P≤0.0063)；与亲本或错配HLA靶细胞共孵育无明显裂解。MIP-1β分泌及IFNγ ELISPOT证实各TCR-T仅响应FOXM1/HLA匹配或对应多肽脉冲靶细胞(P<0.0001)。TCR-T1表型以效应记忆T细胞(T_EM, CD45RA^?CCR7^?CD45RO⁺)为主(~80%)，抗原刺激后部分上调共抑制分子TIM-3、LAG-3、PD-1及早期活化标志CD25、CD69。

FOXM1-specific TCR-T cells are unresponsive to healthy organs

将HLA-A02:01转导的正常组织原代细胞系(心、脑、肝、肾、肺)与TCR-T1共孵育，MIP-1β分泌显著低于肿瘤靶细胞(P<0.0001)，平均裂解率为心0%、肾0%、脑0%、肝2.1%、肺1.6%，而H1975 FOXM1(HLA-A02:01)为32.7%(P<0.0001)，表明TCR-T1不因正常组织低水平FOXM1而活化，预期on-target off-tumor毒性低。

FOXM1-specific clonotypes are detected in patients with lung cancer

以IYTWIEDHF刺激HLA-A*23:01纯合NSCLC患者PBMC，低起始频率(0.19%)可扩增至82.9% tetramer⁺且具IFNγ分泌功能。GLIPH2分析ICON与PROSPECT队列NSCLC TCR库，发现与TCR-T1、TCR-T2、TCR-T4 CDR3β相似的克隆型广泛存在，说明FOXM1特异性T细胞克隆可在患者体内自然产生。

FOXM1-specific TCR-T cells are sensitive and specific

多肽梯度滴定⁵¹Cr释放测得各TCR-T log EC₅₀≤1.4 nmol/L(TCR-T1 1.4、TCR-T2 1.3、TCR-T3 1.0、TCR-T4 0.2 nmol/L)。TCRmodel2构建TCR–pMHC复合物显示TCR-T1识别表位P1/P4–P7残基，丙氨酸扫描(X-scan)证实P5–P8单位点突变致MIP-1β分泌显著下降。TCR-T1可识别内源性FOXM1/HLA-A*02:01⁺NSCLC细胞系(DFCI032、MDA-L-30)并分泌MIP-1β(P<0.0001)，表明其对生理水平肿瘤抗原具高灵敏度与特异性。

FOXM1 TCR-T cells result in prolonged survival in vivo

NSG小鼠皮下接种H1975 FOXM1(HLA-A*02:01⁺)成瘤后，随机分为PBS、未转导T细胞、TCR-T1组(各n=10)，分别于d4/d7经尾静脉输注1×10⁷TCR-T1或对照，联合腹腔注射IL-15/IL-15Rα。TCR-T1组肿瘤体积显著小于对照组(P<0.0001)，中位生存期显著延长。外周血d10/d23可检出CD8⁺tetramer⁺TCR-T细胞，未见明显体重下降或急性毒性体征，证明TCR-T1在体内可持久定植、有效抑瘤并改善生存。

讨论与结论

研究人员证实FOXM1在NSCLC中广泛高表达而在正常实质器官极低，属理想TAA。首次报道并验证了靶向FOXM1 HLA-A02:01限制性表位YLVPIQFPV及HLA-A24:02/A23:01限制性表位IYTWIEDHF的高亲和力TCR克隆，构建了具高灵敏度(log EC₅₀≤1.4 nmol/L)、严格HLA/表位特异性及低正常组织交叉反应的TCR-T细胞。在NSG小鼠模型中TCR-T细胞过继转移显著缩小NSCLC来源肿瘤并延长存活，且未在HLA-A02:01转导的多种正常人原代细胞中诱发明显脱颗粒或裂解。NSCLC患者体内亦存在FOXM1反应性TCR克隆型，支持该靶点具生理相关性。相比FOXM1小分子抑制剂或肽疫苗，TCR-T可提供更强持续杀伤，尤其RET重排等FOXM1高表达亚型或受益更多。研究局限含需更大临床队列验证特定分子亚型优选人群、需进一步监测增殖组织中FOXM1短暂表达对on-target off-tumor毒性的潜在影响。结论：FOXM1是NSCLC TCR-T疗法可行且安全的靶抗原，本研究为靶向FOXM1的TCR-T细胞治疗NSCLC及其他FOXM1高表达实体瘤向临床转化奠定了临床前基础。