《Cancer Immunology Research》：DDR1 Promotes Immune Evasion in Colorectal Cancer by Orchestrating IL33-Mediated M2-like Polarization of Tumor-Associated Macrophages
Open Access
编辑推荐：
摘要：结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)仍是癌症相关死亡的主要原因，错配修复功能正常(pMMR)型CRC因肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TIME)呈免疫抑制状态导致免疫治疗有效率低下，而pMMR型占CRC大多
摘要：结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)仍是癌症相关死亡的主要原因，错配修复功能正常(pMMR)型CRC因肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TIME)呈免疫抑制状态导致免疫治疗有效率低下，而pMMR型占CRC大多数。本研究确定盘状结构域受体1(Discoidin domain receptor 1, DDR1)是同源肿瘤模型中关键的免疫逃逸驱动因子。此外，肠道特异性Ddr1基因敲除(Knockout, KO)抑制偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(Azoxymethane/dextran sulfate sodium, AOM/DSS)及ApcMin/+小鼠CRC模型中的肿瘤发生，伴M2样肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAM)比例降低及CD8+T细胞浸润增加。机制上，DDR1诱导p-c-Jun依赖的IL33转录以驱动M2样巨噬细胞极化。质谱与免疫沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)分析进一步揭示DDR1在细胞核内与DExD-box helic酶21(DDX21)相互作用，抑制DDX21泛素化使其水平升高，进而增强c-Jun磷酸化。临床上，CRC患者癌组织中DDR1高表达与不良预后相关，且与DDX21及p-c-Jun呈正相关；DDR1与DDX21表达均与患者组织中M2样TAM浸润呈正相关。治疗上，基因敲除及纳米颗粒递送siRNA靶向Ddr1显著增强体内抗PD-1(PD-1 monoclonal antibody, αPD-1)治疗疗效。因此，研究确立DDR1–DDX21–c-Jun–IL33轴通过调控TAM极化驱动CRC免疫抑制，表明DDR1是改善pMMR患者免疫治疗疗效的潜在靶点。
论文解读：DDR1–DDX21–c-Jun–IL33轴通过诱导M2样TAM极化促进结直肠癌免疫逃逸及靶向增敏价值
一、研究背景与立项依据
结直肠癌(CRC)是全球癌症相关死亡的第二大原因。免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade, ICB)如抗PD-1治疗仅对约5%的微卫星高度不稳定/错配修复缺陷(MSI-H/dMMR)患者有效，绝大多数错配修复功能正常(pMMR)型CRC表现为"冷"肿瘤免疫微环境(TIME)——CD8+T细胞浸润不足且富含免疫抑制细胞。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可向具有抗肿瘤活性的M1样或促瘤、免疫抑制的M2样表型极化，M2样TAM富集是CRC免疫逃逸的重要特征。盘状结构域受体1(DDR1)为胶原激活的受体酪氨酸激酶，既往报道其在三阴性乳腺癌中通过排列胶原纤维阻碍T细胞浸润，在CRC中可上调PD-L1并抑制IL-18合成，但DDR1是否及如何通过调控TAM极化塑造CRC免疫抑制微环境尚不清楚。该研究旨在阐明DDR1在CRC中介导TAM极化的机制及其作为ICB增敏靶点的价值。
二、主要关键技术方法概要
研究收集上海东方医院54例CRC患者标本及99例人CRC组织芯片(TMA)，进行生存与相关性分析。体外采用CRISPR/Cas9构建DDR1敲除(KO)及慢病毒过表达(OE)的CRC细胞株(MC38、CT26、HCT116、DLD1、RKO、SW620等)，CCK-8、克隆形成评估增殖；Western blot、qRT-PCR、ELISA检测IL-33及信号分子；Co-IP联合质谱鉴定DDR1互作蛋白DDX21，核质分离定位，截断体作图定位结合域，CHX追踪半衰期、MG132处理及泛素化实验验证DDX21稳定性；双荧光素酶报告检测c-Jun对IL33启动子活性。体外Transwell或直接接触共培养骨髓源巨噬细胞(BMDM)/THP-1来源巨噬细胞与CRC细胞，流式检测CD206+(M2样)、CD86+(M1样)比例；CFSE稀释、CD25/CD69检测T细胞增殖活化。体内建立C57BL/6、BALB/c皮下移植瘤，MC38直肠原位种植瘤，肠道特异性Ddr1flox/floxVillin-Cre(CKO)小鼠经AOM/DSS化学诱导及ApcMin/+自发瘤模型；氯膦酸盐脂质体或抗CSF1R单抗清除/阻断巨噬细胞；抗IL-33中和抗体体内处理；脂质纳米颗粒(LNP)包裹siDdr1行基因沉默联合抗PD-1治疗；流式及多重免疫荧光(IF)分析瘤内免疫细胞。公共GEO数据集(GSE44861、GSE103479)及Kaplan–Meier plotter做生物信息学验证。
三、研究结果
DDR1 promotes colorectal cancer growth through an immunosuppressive function（DDR1通过免疫抑制功能促进CRC生长）
研究人员发现CRC组织DDR1 mRNA及蛋白高于癌旁，高DDR1预示更差总生存期(OS)。DDR1-OE不改变CRC细胞体外增殖，但在免疫健全小鼠中促进皮下及原位瘤生长、减少CD8+T细胞并增加M2样TAM；Ddr1-KO则抑瘤、减M2样TAM并增CD8+T细胞浸润，在NOD/SCID免疫缺陷鼠中无生长差异，证实DDR1促瘤依赖免疫抑制而非直接促增殖。
DDR1 drives M2-like macrophage polarization（DDR1驱动M2样巨噬细胞极化）
Transwell共培养显示DDR1-OE CRC细胞条件培养基上调BMDM及THP-1来源巨噬细胞的CD206+比例及M2标志物(Arg1、Mrc1等)，下调M1标志物(Il12b、Nos2)；Ddr1-KO反之。体内氯膦酸盐脂质体去除巨噬细胞后Ddr1-KO组肿瘤不再进一步缩小，表明DDR1促瘤部分依赖M2样TAM；抗CSF1R阻断M2样TAM也消除DDR1-OE的生长优势。Ddr1-KO条件培养基预处理的BMDM对CD8+T细胞增殖(CSFE稀释)及活化(CD25+CD69+)抑制减弱，证明DDR1-educated巨噬细胞具免疫抑制功能。
DDR1 is associated with colorectal tumorigenesis and tumor immunity in mice（DDR1参与小鼠结直肠肿瘤发生及肿瘤免疫）
肠道特异性Ddr1-CKO小鼠AOM/DSS及ApcMin/+模型中，肿瘤数目、体积减小，瘤内M2样TAM↓、M1样TAM↑、CD8+T细胞↑，总TAM(F4/80+)不变。MC38原位模型中Ddr1-OE增M2样TAM、减CD8+T细胞促瘤，反向验证DDR1在生理性及自发性CRC发生发展中对TIME的重编程作用。
DDR1 promotes M2-like macrophage polarization via IL33（DDR1经由IL-33促进M2样巨噬细胞极化）
细胞因子筛查发现DDR1-OE显著上调IL33 mRNA、胞内蛋白及培养上清分泌，Ddr1-KO下调。用抗IL-33中和抗体可抵消DDR1-OE条件培养基诱导的M2样极化及M2标志物上调；重组IL-33(rIL-33)直接剂量依赖性诱导BMDM/THP-1向M2样极化。体内抗IL-33中和抵消Ddr1-OE引起的促瘤、M2样TAM增多及CD8+T减少，确认IL-33是DDR1下游关键效应分子。
DDR1 induces IL33 transcription through the DDX21–c-Jun axis（DDR1通过DDX21–c-Jun轴诱导IL33转录）
DDR1-OE增强JNK/c-Jun磷酸化，JNK抑制剂SP600125抑制p-c-Jun及IL-33上调；荧光素酶报告证实c-Jun过表达激活IL33启动子，说明DDR1经p-c-Jun上调IL33。Co-IP+质谱鉴定核内DDR1互作蛋白DDX21(DEAD-box helicase 21)，内源性Co-IP及IF共定位验证二者在核内结合，DDR1胞质近膜(JM)域介导结合。DDR1-OE升高DDX21总蛋白(尤其核内)，Ddr1-KO降低；MG132恢复Ddr1-KO细胞中DDX21，CHX示Ddr1-KO缩短DDX21半衰期，Co-IP示Ddr1-KO增DDX21泛素化、DDR1-OE减其泛素化，表明DDR1抑制DDX21蛋白酶体降解。Co-IP显示DDX21与c-Jun互作且DDR1-OE增强此互作；在Ddr1-KO细胞中回补DDX21可恢复p-c-Jun及IL-33表达。小鼠中Ddx21回补挽救Ddr1-KO导致的抑瘤、M2样TAM减少及IL-33下调，确立DDR1–DDX21–p-c-Jun–IL33信号级联。
Targeting DDR1 potentiates PD-1 blockade for colorectal cancer immunotherapy（靶向DDR1增强抗PD-1治疗CRC疗效）
Ddr1-KO联合抗PD-1较单药更强抑制MC38及"冷"CT26肿瘤生长，增瘤内IFNγ+及颗粒酶B+(GZMB+) CD8+T细胞。LNP-siDdr1单药抑瘤，联用抗PD-1协同增效并提升CD8+T细胞毒性。临床TMA示DDR1与DDX21、p-c-Jun正相关，DDR1及DDX21均与CD206+M2样TAM密度正相关；公共数据库CRC中DDX21、IL33与M2富集分(ssGSEA)正相关，佐证该轴临床相关性。
四、讨论与结论翻译
讨论指出DDR1除已知T细胞排斥功能外，还通过核内与DDX21互作抑制其泛素化降解，稳定DDX21蛋白并促进c-Jun磷酸化，进而转录激活IL33，IL-33旁分泌驱动TAM向M2样极化、抑制CD8+T细胞功能，塑造免疫抑制TIME。肠道特异性Ddr1缺失在化学诱导及ApcMin/+自发模型中均抑制CRC起始并逆转免疫抑制表型。遗传敲除或LNP-siRNA靶向Ddr1可重编程TAM、增敏抗PD-1，为pMMR CRC的联合免疫治疗提供新靶点。
研究结论（翻译）： 研究人员证实DDR1在结直肠癌中通过与核内DDX21相互作用抑制其泛素化降解，稳定DDX21以促进c-Jun磷酸化并激活IL33转录；IL-33旁分泌诱导肿瘤相关巨噬细胞M2样极化，减少CD8+T细胞浸润，从而促进免疫逃逸和肿瘤进展。靶向DDR1（基因敲除或LNP-siRNA）破坏DDR1–DDX21–c-Jun–IL33轴，重编程免疫微环境并显著增强抗PD-1治疗疗效，DDR1是改善pMMR结直肠癌免疫治疗效果的潜在治疗靶点。本研究发表于《Cancer Immunology Research》。
