《npj Biological Physics and Mechanics》：Laser optical tweezers for studies of biomolecules in the post-reductionist era
编辑推荐：
激光光镊（Laser Optical Tweezers，LOT）是一种单分子力谱（Single-Molecule Force Spectroscopy，SMFS）技术，能够以亚皮牛（sub-piconewton）分辨率对单个分子所受作用力进行直接、实时测量。此
激光光镊（Laser Optical Tweezers，LOT）是一种单分子力谱（Single-Molecule Force Spectroscopy，SMFS）技术，能够以亚皮牛（sub-piconewton）分辨率对单个分子所受作用力进行直接、实时测量。此外，LOT可在受控条件下直接操控单个分子，从而实现对染色质压缩、模板介导的蛋白质错误折叠、T4噬菌体马达的DNA包装、转录与翻译机器功能，以及SNARE蛋白复合物在膜融合中作用等过程的精细解析。LOT的核心优势在于能够将单个生物大分子的力学特性与更大尺度的（亚）细胞过程相关联，从而在单分子生物物理特性与细胞的复杂本质之间建立机制性联系。这是推动机械生物学发展、深化对生物背景下生物大分子功能认知的关键一步，尤其在后还原论研究中具有重要意义。
引言
生物学过程的研究可采用两种互补路径：自上而下的组学（omics）方法与自下而上的单分子方法。组学侧重回答“存在什么及其数量”，单分子研究则聚焦“如何运作及为何如此”。二者虽看似方法对立，却互为补充，反映了从还原论到后还原论的认识论转变。传统生物物理还原论将分子组分从其生物背景中分离，在受控条件下表征其固有结构或生化特性，虽揭示了基础机制，但依赖群体测量与平衡假设，难以反映分子异质性与环境依赖性。“Humpty-Dumpty”类比形象地指出：即使能将生物系统拆解为基本组分，也无法保证其功能完整性被还原。后还原论生物物理并未放弃分子精度，而是将单分子测量嵌入功能性、多组分、动态调控的生物环境中，研究对象从孤立组分转向近生理或主动驱动条件下的力学与动力学耦合系统。
激光光镊（LOT）由高度聚焦的激光束形成三维势阱捕获微粒，核心组件包括相干激光源、光束整形光学元件与高数值孔径（Numerical Aperture，NA）物镜，焦点附近的陡峭光强梯度是稳定捕获的关键条件，最适用于折射率高于周围介质透明介电物体；针对不对称、金属或吸光粒子，常需调整光路配置（如双光束或对向传播光路）以维持稳定捕获。Arthur Ashkin因其在光捕获领域的奠基性发现获2018年诺贝尔物理学奖，推动了商用光镊平台（如Lumicks、Bruker等）的发展。当前定制系统与商用仪器形成协同：商用系统降低了技术门槛，扩大了应用范围；定制系统则保留了灵活性与定制化空间，持续驱动方法学创新与基础发现，尤其是后还原论单分子研究。
LOT通过直接探测单个分子，提供生物大分子结构层级的定量力学信息，克服了群体平均的局限性，既保留了还原论对分子固有特性的精确表征优势，又通过技术进步实现了亚纳米级结构变化与宽时间尺度的检测。更重要的是，LOT可突破还原论的边界：在复杂多组分系统中，群体平均会掩盖结构与动力学异质性，无法推断涌现行为；而光镊在保留分子尺度精度的同时，支持对力学耦合组装体、力依赖通路及非平衡生物系统的可控探测，通过对网络中单个功能“节点”的探测，生成高分辨率定量约束，将描述性观察转化为预测性机制模型，界定系统行为的经验边界。近三十年LOT相关研究显著增长，近年年发文量达400–500篇，已形成多个细分研究方向。本文按核酸、蛋白质、噬菌体马达、超分子组装体、膜融合与细胞张力五个主题展开论述。
测量DNA压缩动力学
Sun等人利用LOT结合非洲爪蟾卵提取物，在生理无细胞条件下研究了有丝分裂染色质纤维的形成与力诱导解组装。实验将单个DNA分子两端连接微球，一端固定于显微移液管，另一端置于光阱中；加入高速提取物（High-Speed Extract，HSE）后，内源性染色质组装机器（含组蛋白与染色质相关因子）作用于DNA，可直接测量压缩力。时间分辨轨迹显示：低力（1.5 pN）下DNA轮廓长度显著缩短，对应自发染色质组装与纤维压缩；高力（15 pN）下纤维可逆解组装，体现力依赖性染色质可塑性。该研究虽提供了环境依赖性DNA压缩动力学的洞见，但需注意有限组蛋白结合与LOT施加的张力可能影响DNA拓扑，结果未必完全反映天然染色质行为。
与之对比，2018年一项研究仅用分离的荧光标记酵母凝聚蛋白（condensin）研究DNA压缩，证明凝聚蛋白可通过促进DNA环形成实现压缩。这体现了还原论与后还原论的差异：还原论策略可高精度定义凝聚蛋白的机化学活性，但无法完全捕捉其在生理相关染色质环境中的调控、稳定与限制机制；而基于提取物的光镊检测在保留分子尺度力分辨率的同时，将测量嵌入多组分组装环境，揭示了依赖凝聚蛋白、组蛋白及相关因子互作的染色质压缩涌现特性，实现了从识别催化能力到量化近生理条件下功能相关性的跨越。
检测蛋白质的模板介导错误折叠
蛋白质需正确折叠以维持功能，基因突变常导致折叠异常，引发多种疾病。在朊病毒及类朊病毒疾病中，单个氨基酸置换即可改变蛋白稳定性，诱发错误折叠，并作为种子驱动天然正确折叠蛋白向错误折叠构象转化。模板介导蛋白错误折叠对传统生物物理方法构成挑战：评估突变模板对野生型折叠的影响时，圆二色谱、硫黄素T荧光或量热法等群体技术报告的是混合群体的平均结构变化，温度、pH或化学变性剂会同时作用于突变体与野生型，难以区分构象转变源于模板互作还是某一群体的固有不稳定性。
这一局限反映了还原论群体方法的普遍约束：虽可高精度表征固有热力学性质，却掩盖了通路异质性与分子间变异性。单分子力谱通过直接解析单个异二聚体的折叠轨迹，可实时观测突变与野生型亚基间的力学与动力学耦合，在保留还原论测量精度的同时，揭示构象状态如何在互作分子组装体中传递，将分子精度延伸至环境依赖的后还原论框架。
Neupane等人利用LOT首次在单分子水平观察到超氧化物歧化酶-1（Superoxide Dismutase-1，SOD1）的朊病毒样模板介导错误折叠，证明了单个蛋白折叠的环境依赖性。在野生型与突变型SOD1组成的异二聚体中，错误折叠的突变体加速了野生型亚基的结构变化，形成多个亚稳态中间体；力-延伸轨迹显示出典型的模板介导错误折叠传播特征，且伴随可测量的酶活性下降，证明构象变化直接影响功能。
哺乳动物对朊病毒疾病的易感性存在物种差异：犬（抗病）、仓鼠（易感）与堤岸田鼠（高易感）的朊病毒蛋白（PrP）序列高度相似，但折叠通路差异显著。光镊实验表明，抗病物种犬的PrP（CaPrP）通过多条复杂通路折叠，存在多个中间体；堤岸田鼠的PrP（BvPrP）折叠通路更刚性，遵循特定中间体路径，易形成亚稳态错误折叠构象；仓鼠的PrP（HaPrP）通路最简单，呈开关式折叠，仅存在正确折叠与未折叠两种状态，无 detectable 中间体。单分子方法明确了能垒与动力学是朊病毒抗性的驱动因素，相关蛋白折叠受其他蛋白调控的研究已在综述中系统总结。
噬菌体DNA包装马达的实时观测
噬菌体生命周期为研究复杂力依赖过程提供了理想模型。在分子马达与DNA包装机化学领域，噬菌体马达是研究热点。LOT对T4噬菌体马达的实验证实其可产生约60 pN的高力与约2000 bp/s的速度，是已知最强分子马达之一（对比骨骼肌肌球蛋白II仅产生约2–3 pN力）。
噬菌体DNA易位的核心问题是易位是否受底物DNA序列影响，“B-A收缩虫模型”（B-A scrunchworm model）曾推测序列会影响速率。研究人员将T4马达连接在衣壳与微球之间，DNA底物锚定至第二个微球，在ATP饱和溶液中诱导包装，采用力钳模式（force-clamp mode）持续调整两微球位置以维持恒定力，追踪包装长度与进程时间，明确证实T4噬菌体DNA易位实际上对DNA序列组成不敏感。
类似研究在λ噬菌体中开展：构建包含前衣壳、末端酶（terminase）、整合宿主因子（Integration Host Factor，IHF）与含cos（包装起始）位点的DNA的马达复合物，用不可水解ATP类似物启动包装后停滞，将DNA游离端生物素化连接微球、前衣壳连接第二个微球，双光阱施加约5 pN恒定力，加入ATP重启停滞复合物，LOT实时追踪包装DNA长度。除马达蛋白力学外，光镊还可量化噬菌体与其靶抗原的互作动力学，结合纳米技术创新，已实现基于光流控芯片平台的单个病毒颗粒无标记、快速、精准表征。
对噬菌体DNA包装马达而言，结构与生化分析确立了ATP驱动构象循环是易位的机制基础，但仅有力钳光镊实验揭示T4马达可产生接近数十皮牛的力并维持高速包装，且性能对DNA序列组成高度不敏感，这些测量定义了该生物机器的物理极限与鲁棒性。研究视角从孤立催化复合物的固有参数，转向近生理条件下力调控的功能行为，实现了从“马达能做什么”到“马达在生物操作物理约束下如何表现”的认知跨越。
转录与翻译机制的解析
转录与翻译的结构基础由结构生物学的还原论方法确立：Steitz、Ban等人的高分辨率X射线晶体学与冷冻电镜研究解析了兆道尔顿核糖体与聚合酶复合物的结构，揭示了活性位点几何、亚基组织与因子结合界面，回答了这些分子机器“如何构建”的问题。
但结构解析无法描述复合物的动态功能。转录与翻译本质上是非平衡过程，涉及随时间变化的协调构象变化、力学应变与能量转换。后还原论方法需要将结构精度、动力学分辨率与直接力学探测相结合，光镊通过在核酸底物上施加校准力并监测单碱基分辨率易位，实现了这一整合。还原论定义了转录与翻译复合物的结构与固有催化特性；后还原论保留这一精度，将复合物嵌入更贴近生物现实的力学约束环境中，问题从“聚合酶或核糖体结构如何”转向“这些机器如何做功、响应障碍并在负载下调整动力学”。
真核生物转录是高度动态调控的过程，需要核小体持续重组以允许RNA聚合酶II（RNA Polymerase II，Pol II）穿越染色质。组蛋白伴侣FACT（Facilitates Chromatin Transcription）通过削弱核小体DNA-组蛋白相互作用、辅助Pol II通过并恢复染色质完整性发挥关键作用。Burgos-Bravo等人利用高分辨率双阱光镊实时监测Pol II穿越单个核小体的过程：存在FACT时，核小体穿越中位时间从约200秒缩短至约50秒，穿越概率从约30%提升至约60%，且FACT将解绕DNA-组蛋白复合物所需的高力从约30 pN降至10 pN；结合共聚焦荧光显微镜观测到FACT通过暂时置换H2A-H2B二聚体稳定六聚体样中间体，防止二聚体脱落；力-延伸曲线显示Pol II通过后，FACT协助核小体重组装——无FACT时无完整核小体检出，仅约9%为亚核小体颗粒；有FACT时约10%为完整核小体，约40%为亚核小体结构。
翻译动力学同样受mRNA结构元件（如发夹或假结）影响。Desai等人的研究利用高分辨率光镊与单分子荧光，追踪核糖体解开mRNA发夹与延伸因子EF-G的结合动力学，发现发夹打开与EF-G活性及核糖体30S亚基旋转偶联；核糖体存在变构“换挡”机制，根据遇到的发夹稳定性调整通路：更强屏障会促使核糖体转向更慢的通路，通过调整机化学循环时序响应mRNA结构的物理屏障。
针对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的新型抗生素开发依赖于RNA聚合酶（MtbRNAP）与小分子抑制剂互作的精确表征。研究人员将单个DNA分子两端连接微球并置于双光阱中，以单碱基分辨率监测MtbRNAP的转录过程：通过分析无停顿速度评估无中断时的移动速率，在被动模式下抵抗酶的运动以测定其失速力（stall force，即聚合酶停止前能对抗的最大力）；通过 dwell 时间分布与驻留时间直方图量化MtbRNAP在转录过程中的停顿时长或不同动力学状态的停留时间，明确了三种结构各异的小分子抑制剂的独特机制效应，为抗结核靶向药物设计提供了关键信息。
膜融合与细胞张力的机制
单分子方法已开始为多组分复杂现象（如膜融合、膜-蛋白互作、细胞黏附）提供初步洞见。典型例子是SNARE（Soluble NSF Attachment Receptor）复合物的表征：SNARE复合物是多蛋白机器，介导囊泡与真核细胞膜的融合，参与细胞间信号转导。连续反向拉链反应积累的机械能必须释放，以克服膜与囊泡间的排斥力。传统膜融合研究长期依赖还原论方法，在受控条件下研究分离的SNARE蛋白，可测量蛋白-蛋白互作，但群体平均会掩盖瞬态中间体、无法解析动力学异质性，且体内SNARE组装并非在无力学约束下发生——融合需要克服膜排斥、脂质变形与细胞骨架张力，SNARE复合物的动力学与稳定性因此受相对膜施加的对抗力调控。纯粹还原论描述仅能捕捉固有能量学，无法量化机械负载如何改变组装动力学或调控融合效率。
后还原论方法在保留分子分辨率的同时，将SNARE复合物嵌入力学耦合背景中。基于光镊的单分子力谱对单个复合物施加校准外力，可直接测量力依赖的拉链步骤、中间体稳定化，并量化组装过程中生成的机械功，将分析从描述蛋白-蛋白互作转向量化分子能量学如何在负载下转化为功能性膜融合。
单分子方法可实时分析SNARE复合物的精确折叠通路，并定量驱动组装的力学力。Gao等人的单分子操控实验将神经元SNARE复合物蛋白分子锚定于聚苯乙烯微球，通过蛋白交联组装SNARE复合物，对完整复合物进行牵引获得力-延伸曲线与力钳延伸轨迹，证实了拉链假说：拉链过程以三个开关式步骤发生，而非连续过程，形成半拉链式中间体；外部施加的力（类似于近距离两膜的排斥力）可稳定该中间体。研究量化了组装过程中间体相关的机械功与特定力，所有研究的SNARE复合物遵循相同折叠通路，但折叠能不同。传统群体研究会将SNARE复合物的离散瞬态中间体平均掉。多项光镊研究进一步证实，光镊是阐明SNARE组装力学原理、揭示瞬态中间体、量化拉链力并将分子力学与膜融合关联不可或缺的工具。
光镊的应用还从SNARE复合物动力学扩展至细胞尺度膜张力调控研究。细胞张力传递是维持突起、收缩或黏附等生理过程的基本整合机制。以往膜张力研究仅利用外源性施加的力，结果不明确；结合光遗传学控制后，可诱导局部突起与收缩，引发膜张力的快速全局升高。当通过双阱牵引施加外源性力时，肌动蛋白皮层作为结构支架或屏障阻止张力传递，与细胞内源性产生的力表现不同。
展望：体内与复杂环境中的单分子研究
单分子研究的未来进展将来自技术发展与系统复杂性的逐步提升。首先，精准的力控制与实时监测可扩大LOT在现代生物医学研究中的应用范围。空间光调制器（Spatial Light Modulator，SLM）可调制激光束形状并生成多个焦点，形成多光阱的全息光镊（Holographic Optical Tweezers，HOTs）；双阱利用两束对向传播的激光，更适合捕获较大粒子，可降低高功率激光的热损伤风险；角光镊（Angular Optical Tweezers，AOTs）引入圆偏振光，将动量传递给被捕获粒子，为旋转动力学研究提供可能。另一项技术创新是利用二维光子晶体（2D Photonic Crystal，2D PhC）的光镊方法，相比标准高NA物镜，2D PhC可产生更陡、更紧的光强梯度，提升捕获效率，从而降低捕获功率与光热加热风险，减少对活生物样品的损伤。全息光镊与机器人介导的活细胞运输结合，形成了机器人-光镊操控系统。
同样重要的是光镊与互补光谱技术的整合。将力测量与荧光（如FRET）或拉曼光谱结合的关联方法，可同时对异质环境中的生物大分子进行力学与结构探测，这类多模态平台能够获取仅靠孤立组分无法推断的环境依赖行为。光镊从手动操作的还原论仪器向自动化、多模态、近生理平台的演进，不仅是技术层面的精进，更代表了力学信息如何融入生物学认知的概念性转变。通过保留分子精度并将测量嵌入动态耦合系统，单分子力谱日益成为连接分子固有特性与涌现细胞功能的桥梁。从这个意义上说，激光光镊不仅是还原论分析的工具，更是支撑后还原论框架的核心仪器。
