《npj Biomedical Innovations》：Human colon organoid Transwell model for investigating epithelial growth and repair
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炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）中肠道上皮屏障的破坏是其标志性特征，然而上皮修复的机制仍知之甚少。研究人员开发了一种可扩展的人结肠类器官（organoid）衍生模型，置于96孔Transwell系统中，该模型再现了天
炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）中肠道上皮屏障的破坏是其标志性特征，然而上皮修复的机制仍知之甚少。研究人员开发了一种可扩展的人结肠类器官（organoid）衍生模型，置于96孔Transwell系统中，该模型再现了天然上皮细胞的多样性和屏障功能。利用这一平台，研究人员调查了各种生长因子和细胞因子如何影响模拟炎症损伤后的上皮成熟与修复。研究结果表明，修复性因子，特别是表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGF）和转化生长因子-alpha（Transforming Growth Factor-alpha, TGFα），在急性和慢性炎症条件下，通过减少细胞死亡并支持细胞增殖，显著增强了屏障完整性。此外，研究还展示了免疫调节细胞因子白细胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）和白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）对上皮细胞的直接保护作用。这一稳健的模型为解析肠道修复机制以及筛选促进IBD粘膜愈合的潜在治疗药物提供了一种强大的高通量工具。
**论文解读**
炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD），包括克罗恩病（Crohn's disease, CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC），是一种慢性且易复发的胃肠道炎症性疾病，给临床带来了巨大挑战
1,2,3,4,5。尽管治疗策略不断进步，但实现完全且持久的缓解对许多患者而言依然困难。IBD发病机制和进展中的一个关键因素是肠道上皮屏障的破坏，这对于维持肠道稳态至关重要
2,3,5。因此，有效的上皮修复和再生对于恢复屏障功能和实现长期缓解至关重要。肠道上皮是一种动态组织，受生长因子和细胞因子复杂相互作用的调节，持续进行更新和修复
6,7,8,9。这些动态过程涉及增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞活动，对维持上皮完整性和功能至关重要
8,10。信号通路的失调可能导致IBD背景下的伤口愈合受损和慢性炎症
11,12,13。因此，探索各种生长因子和细胞因子，通过促进上皮细胞增殖和迁移以协助组织修复，或通过调节炎症反应和上皮再生来治疗IBD，成为研究热点
12,14。为了更好理解这些因子在上皮修复中的具体作用和机制，从而开发针对IBD患者的靶向疗法，亟需一种比动物模型更易用、更易获取，且能再现体内复杂细胞相互作用的体外模型。近年来，结肠类器官的发展为研究结肠上皮提供了生理相关性模型系统，为研究生长因子和细胞因子对上皮修复过程的影响提供了独特平台
15,16,17。通常，结肠类器官在基底膜基质中培养，这限制了研究人员对上皮顶端和基底侧隔室的访问，使得评估屏障完整性具有挑战性
18,19。尽管已有研究将结肠类器官解离并在2D条件下培养形成上皮用于功能和安全评估
20,21,22,23,24,25,26,27，但尚未见利用该系统评估不同生长因子和细胞因子在结肠上皮发育及炎症后修复中作用的报道。
基于此背景，研究人员开展了一项研究，旨在描述和表征一种基于结肠类器官衍生的2D上皮模型，该模型置于96孔Transwell系统中，用于评估生长因子和细胞因子在结肠上皮发育及炎症后修复中的作用。研究人员交叉比较了多种常用生长因子和细胞因子的作用，旨在为未来鉴定增强IBD患者上皮愈合潜在治疗靶点的研究提供见解。
为开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，从捐赠者网络西部分享（Donor Network West）获得的健康供体（一名36岁女性）的结肠隐窝中分离出结肠类器官，并在Cultrex BME中培养。随后，将类器官解离为单细胞，接种于预涂有I型胶原蛋白的96孔Transwell系统中，先在生长培养基中培养2天以附着和生长，随后切换至去除EGF并降低Wnt信号水平的分化培养基中诱导分化，形成具有极性的单层结肠上皮。接着，研究人员利用跨上皮电阻（Transepithelial Electrical Resistance, TEER）测量、免疫荧光染色、基因表达分析、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放测定、细胞存活率检测（CellTiter-Glo）以及5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU）掺入实验等技术，系统评估了上皮屏障完整性、细胞类型组成、增殖、凋亡及存活情况。炎症损伤通过向基底侧添加肿瘤坏死因子-alpha（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）、干扰素-γ（Interferon-gamma, IFN-γ）和白细胞介素-1beta（Interleukin-1 beta, IL-1β）模拟。研究的主要技术方法包括TEER监测屏障功能、免疫荧光鉴定细胞标记物（如FABP1, MUC2, E-cadherin, ZO-1等）、以及基于发光信号的细胞活力和增殖分析。
研究结果部分首先展示了人结肠类器官在Transwell系统中的发育和表征。类器官衍生的上皮细胞在汇合时呈现紧密排列的多边形形态，形成典型的上皮细胞层鹅卵石状图案（Fig. 1B）。TEER值在培养前5天显著增加后趋于平稳，表明功能性上皮屏障的建立（Fig. 1A）。免疫荧光染色显示，随着分化进行，干细胞和前体细胞标记物（如Ki67）比例下降，而成熟肠细胞（FABP1+）和杯状细胞（MUC2+）比例增加，细胞连接蛋白E-cadherin和ZO-1表达增强，并检测到少量肠内分泌细胞（CHGA+）（Fig. 1C, S1）。基因表达分析进一步证实，干细胞标记物（如CDK6, SOX9, LGR5等）表达下调，而结肠特异性细胞标记物（如FCGBP, MUC2, TFF3等）及细胞粘附/连接基因（如EPCAM, CDH1）显著上调，证实细胞成功形成了包含结肠主要细胞类型的功能性上皮（Fig. 1D）。
其次，研究探讨了生长因子和细胞因子对上皮形成和成熟的影响。在含有不同生长因子（EGF, TGFα, KGF, TFF3）和细胞因子（IL-2, IL-10）的培养基中培养9天，尽管TEER值总体相似，但表型存在差异。修复性因子EGF和TGFα促进了上皮成熟，表现为E-cadherin和ZO-1表达增强，且肠细胞标记物丰富，但杯状细胞数量相对较少，提示这些因子可能优先支持肠细胞分化而限制杯状细胞成熟（Fig. 2C, S2）。TFF3和KGF未显示出与对照组显著差异。免疫调节细胞因子IL-2和IL-10对上皮形成无明显直接影响（Fig. 2C）。
第三，研究评估了生长因子和细胞因子在保护上皮免受长期炎症损伤方面的作用。研究人员使用低剂量炎症细胞因子混合物模拟慢性炎症。结果显示，炎症导致TEER下降和屏障损伤。在治疗7天后，EGF和TGFα组TEER逐渐恢复至与对照组相当或更高水平，而其他因子无显著效果（Fig. 3E, F）。LDH-Glo检测显示所有炎症组细胞死亡增加，但EGF和TGFα组在第7天存活细胞数量与对照组相当或更高，EdU和Ki67染色证实了EGF和TGFα促进了细胞增殖，从而部分挽救了杯状细胞损失并更好地保留了细胞连接（Fig. 3G-I, J, S3）。
第四，研究考察了生长因子在急性炎症后上皮修复中的作用。研究人员先用高剂量炎症细胞因子处理上皮1天诱导急性损伤，随后移除细胞因子并添加生长因子7天。结果显示，对照组和未处理组屏障受损，而EGF和TGFα组屏障保持完整，其他因子仅轻微挽救（Fig. 4B）。EGF和TGFα显著降低了细胞死亡（LDH释放减少）并增加了存活细胞数量。值得注意的是，在所有炎症组中，移除细胞因子后细胞均发生增殖，表明存在内在的增殖介导修复机制，但EGF和TGFα在此条件下并未诱导比其它炎症组更显著的增殖，暗示在炎症得到良好解决且细胞损失不太严重的情况下，增殖的贡献可能不那么关键，而细胞存活和屏障保留更为重要（Fig. 4E, F, S4）。
最后，研究评估了因子在急性炎症期间及随后的保护作用。研究人员在施加高剂量炎症细胞因子的同时添加生长因子1天，然后移除所有因子。结果显示，除了EGF和TGFα外，免疫调节细胞因子IL-2和IL-10也成功维持了屏障完整性，并保留了肠细胞和杯状细胞及细胞连接（Fig. 5B, F, S5）。这与之前长期炎症暴露下的结果形成对比，表明在急性炎症这种细胞死亡未超过再生能力的情况下，IL-2和IL-10通过保护细胞存活发挥作用，而在慢性炎症中，强促增殖因子如EGF和TGFα更为有益（Fig. 3 vs Fig. 5）。
在讨论部分，研究人员总结了该研究建立的96孔Transwell人结肠类器官衍生上皮模型，具有多样细胞类型和功能屏障，适用于研究上皮发育、生长因子反应性和炎症应激下的屏障修复。研究证实，EGF和TGFα作为修复性因子，通过减少细胞死亡、支持增殖（在慢性炎症中）和保留上皮结构，在急性炎症修复中发挥关键作用。此外，研究意外发现了免疫调节细胞因子IL-2和IL-10对上皮细胞的直接保护作用，不仅限于其经典的免疫调节功能，还涉及上皮类型的维持。研究局限在于使用了人工定义的促炎细胞因子混合物，未能完全再现体内炎症环境的复杂性。综上所述，本研究建立了一个可扩展的人结肠上皮模型，证明了促进上皮成熟、限制细胞死亡和支持增殖能力是上皮韧性和恢复的关键决定因素，为IBD的再生策略开发提供了重要工具和见解。该论文发表在《npj Biomedical Innovations》。
