同位素稀释液相色谱-串联质谱法用于麦角生物碱的定量：一项比较研究

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Isotope dilution LC-MS/MS for the quantification of ergot alkaloids: a comparative study

麦角生物碱（EAs）是由多种真菌（尤其是感染黑麦、小麦和大麦等谷物的紫麦角菌（Claviceps purpurea））产生的有毒次生代谢产物。由于其毒性，欧盟委员会于2022年建立了谷物及相关产品中12种优先EAs的最大限量。常规监测通常采用高效液相色谱-串联质谱法，但受到缺乏同位素标记内标的挑战。为解决此问题，研究人员先前合成了12种优先EAs的内标（ISTDs），并在本文中通过实验室间比较，对照EN 17425中规定的标准加入法评估了其性能。ISTDs显著提高了方法精密度和准确度，两个实验室的结果高度一致。此外，研究人员根据ISO 33405指南，采用稳定同位素稀释质谱法作为主要方法，开发了黑麦粉中EAs的参考物质。该内部参考物质通过支持EAs的可靠方法开发和验证，有助于更安全的食品。

**论文解读文章**

**研究背景**
麦角生物碱（ergot alkaloids, EAs）是由多种真菌（主要为紫麦角菌Claviceps purpurea）产生的有毒次生代谢产物，可感染黑麦、小麦、大麦等谷物作物，引发中世纪欧洲著名的“圣安东尼之火”（麦角中毒）。EAs基于麦角林（ergoline）四环骨架，分为三类：棒麦角素（clavines）、简单麦角酸酰胺（simple lysergic acid amides）和麦角肽碱（ergopeptines）；其中麦角肽碱和简单酰胺在C8位易发生差向异构化，形成活性较低的8S-差向异构体（“-inine”型）。欧洲食品安全局（EFSA）于2012年建议12种优先EAs的每日耐受摄入量为0.6 μg/kg体重，欧盟委员会于2022年对谷物及制品中12种优先EAs总量设定了最大限量（黑麦制品500 μg/kg至婴幼儿谷物食品20 μg/kg），并计划于2024年进一步降低限量，后推迟至2028年。欧洲标准化委员会（CEN）的EN 17425标准规定了高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）结合单点标准加入法（standard addition, SA）的测定方法，但该方法面临提取效率差异和基质效应等挑战。同位素标记内标（ISTD）可提供更稳健的替代方案，稳定同位素稀释质谱法（SIDA-MS）被国际计量组织（CCQM）认定为主要比值方法，可提供SI单位制溯源性。然而，此前12种优先EAs的ISTD在科学界或商业上均不可得。为此，研究人员先前开发了半合成方法，制备了¹³CD₃标记的ISTD。本研究的目的是：（1）通过实验室间比较，评估EN 17425中标准加入法与ISTD方法的性能；（2）利用ISTD方法筛选天然污染的黑麦粉，依据ISO 33405指南制备参考物质（RM），用于方法验证和常规检测的质量控制。该论文发表在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。

**主要关键技术与方法**
研究人员采用稳定同位素稀释高效液相色谱-串联质谱（SIDA-HPLC-ESI-MS/MS）作为主要定量方法，对比EN 17425中规定的单点标准加入法（SA）。两个实验室（BAM与Eurofins WEJ Contaminants GmbH）参与比较研究，分析六份样品（两种黑麦粉、两种小麦粉、两种面包，由Eurofins提供）。参考物质的制备基于从德国当地超市购买的黑麦粉样品（10个品牌，共19份样品），经均质化（鼓式混合器72 h）后，依据ISO 33405进行均匀性评估（六位点取样、每样三份提取、单因素ANOVA）和等时加速稳定性研究（4°C、22°C、40°C储存6个月，每2个月转移至-18°C参考温度）。不确定度预算结合均匀性（u_bu,r）、稳定性（u_stab,r）、标准品纯度（u_pur,r）和样品处理（u_hand,r=5%）计算，扩展不确定度取k=2。

**研究结果**

**HPLC-MS/MS of EAs**
研究人员优化了碱性流动相条件下的色谱方法，实现了12种优先EAs及其差向异构体在10分钟内基线分离。针对每个未标记和同位素标记的差向异构体，优化了多反应监测（MRM）方法，包括一个定量离子和两个定性离子。对于简单麦角酸酰胺（如麦角新碱/麦角新宁碱），发现天然化合物与其¹³CD₃标记类似物的定性离子相对比例存在显著差异，证实存在两个叠加的碎片离子，其中一个含N6-甲基。据此选择了合适的定性离子。方法的检出限（LOD）为17–58 ng/kg，定量限（LOQ）为67–214 ng/kg，均低于最低校准点500 ng/kg，满足欧盟法规要求。

**Method comparison study**
通过比较六份样品（两种黑麦粉、两种小麦粉、两种面包）中12种EAs总和的测定结果，ISTD方法在两个实验室间的一致性显著优于SA方法。例如，在黑麦粉1号样品（污染最高）中，ISTD方法在BAM和Eurofins的结果分别为（437.3±9.1）μg/kg和（392.3±13.8）μg/kg，而SA方法的结果为（532.9±116.1）μg/kg和（278.1±119.2）μg/kg，后者差异大且精密度差。总体上，ISTD方法有95.8%的定量结果变异系数（CV）<0.2，而SA方法仅54.1%。ΔCV（SA与ISTD方法CV之差）分析表明，SA方法的精密度随EAs质量分数增加而下降。

**Recovery rates and matrix effects**
在实验室内部，两种方法的回收率均值（RR）相当，但ISTD方法的标准差更低。BAM获得的平均RR均在70–120%目标范围内（除SA方法中ergocornine外），而Eurofins报告ergocornine和α-ergocryptine的RR偏低。研究人员通过比较Phenyl-Hexyl柱与C₁₈柱上的色谱行为，发现基质共洗脱是造成某些分析物RR偏低的原因。C₁₈柱上ergocristine和ergosinine的RR显著改善（分别为97%和92%）。尽管存在基质效应，ISTD方法有效校正了干扰，使两实验室的定量结果可比。

**Rye flour reference material**
从10个制造商购买的19份黑麦粉样品中，有一制造商同一批次的4份样品EAs总量为469–934 μg/kg，其中2份超标。研究人员将高污染样品与低污染样品混合，经均质化获得EAs总量约250–300 μg/kg的批料（共7.7 kg）。均匀性研究显示，六位点取样、每样三份的测定结果无系统趋势，单因素ANOVA的P值>0.05，表明样品可在10 g取样量下视为均匀。稳定性研究表明，在4°C和-18°C下储存6个月，EAs总量保持稳定；22°C和40°C下分别下降23%和38%。基于ISO 33405，长期稳定性不确定度设为零。各EAs的扩展不确定度（k=2）为11–13%；12种EAs总和的组合不确定度为4%。该参考物质的认定值在STable中给出。

**总结讨论**
讨论部分指出，EN 17425的标准加入法在浓度约175 μg/kg以下可接受，但在高污染水平下精密度显著下降，且两实验室结果在低水平下也并非一致，尤其对婴幼儿配方食品（限量20 μg/kg）构成担忧。而ISTD方法在不改变EN 17425其他参数的情况下，显著提升了精密度和准确度，提供了更好的基质效应补偿，并减少了每个样品的分析时间（仅需一次提取和测量）。研究人员还指出，基于EN 17425验证研究，该标准仅在24.1–168 μg/kg范围内性能满意，当前方法不足以可靠覆盖所有监管水平。ISTD方法有望应对气候变化、高度加工食品及谷物基肉替代品带来的分析挑战。

**研究结论**
通过实验室间比较研究，研究人员证明采用同位素标记内标（ISTD）方法显著提升了方法精密度和准确度，即使在高污染水平下也能获得一致的实验室间结果。此外，研究人员开发了一种黑麦粉中12种优先麦角生物碱（EAs）的参考物质（RM），依据ISO 33405评估的均匀性和长期稳定性表明，在4°C或以下储存至少6个月内性能稳定。这些发现凸显了基于ISTD的定量方法在提高HPLC-MS/MS分析麦角生物碱的可靠性和可比性方面的潜力，为确保食品分析可靠性及消费者安全提供了稳健解决方案。