骨骼肌肌原纤维中细肌丝与粗肌丝的亚肌小节调控

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Subsarcomeric regulation of thin and thick filaments in skeletal muscle myofibrils

　　

肌肉收缩依赖于肌球蛋白马达从粗肌丝表面的折叠-关闭(oFF)状态和其位于细肌丝上的肌动蛋白轨道在钙离子响应下的协调激活。粗肌丝包含由肌球蛋白结合蛋白C(myosin-binding protein C, MyBP-C)和肌联蛋白超重复序列定义的不同调控区域，但这些区域内肌球蛋白OFF/ON状态的控制尚未被直接解析。本研究中，研究人员通过荧光偏振显微镜(fluorescence polarization microscopy, FPM)在从兔快骨骼肌分离的肌原纤维中实现了这一目标。利用肌球蛋白上的取向特异性探针，研究人员发现放松肌原纤维中折叠-关闭(oFF)的马达富集于含有MyBP-C的C区，表明MyBP-C在该肌丝结构域中稳定了肌球蛋白的OFF状态。在肌联蛋白介导的被动张力或部分钙激活条件下，活性马达富集于缺乏MyBP-C的肌丝末端的D区，提示D区马达在较低的肌丝应力下被激活。肌钙蛋白探针进一步揭示，肌球蛋白在肌丝重叠区域增强了细纹丝的激活，并驱动了细纹丝应力依赖性的激活进入相邻的非重叠区域。这些发现揭示了肌小节内肌丝激活的区域特异性控制，并将FPM确立为研究疾病相关肌丝蛋白变异体及治疗性调控的有力工具。

**研究背景、现有问题与研究目的**

骨骼肌收缩是横纹肌基本收缩单位——肌小节(sarcomere)内包含肌动蛋白的细肌丝(thin filament)和包含肌球蛋白(myosin)的粗肌丝(thick filament)在细胞质钙离子释放触发下协调激活的结果。在静息状态下，细纹丝被肌钙蛋白(troponin)和原肌球蛋白(tropomyosin)关闭，阻止肌球蛋白与肌动蛋白结合；同时，粗肌丝上大部分肌球蛋白马达通过相互作用头基序(interacting-heads motif)折叠回粗肌丝表面，处于不可用于收缩的折叠-关闭(OFF)状态，该结构配置通常对应一种腺苷三磷酸(ATP)周转率显著降低的生化和超松弛(super-relaxed, SRX)状态。激活时，钙离子结合肌钙蛋白促使原肌球蛋白部分移位，暴露肌球蛋白结合位点，使构成性开放(ON)的肌球蛋白马达在肌丝重叠区(A带)结合肌动蛋白产生力。由此产生的应力激活了机械感知反馈机制，促进折叠-关闭(OFF)肌球蛋白马达快速转变为ON状态，进而进一步增强A带内细纹丝的激活。然而，肌球蛋白如何影响缺乏肌丝重叠区域(I带)的细纹丝调控仍不清楚。

粗肌丝每半根可划分为三个结构域：含有肌球蛋白结合蛋白C(myosin-binding protein C, MyBP-C)的中央C区(C-zone)，以及两侧包含肌联蛋白(titin)不同重复序列的P区(P-zone)和D区(D-zone)。MyBP-C和肌联蛋白的变异与骨骼肌和心肌病变相关，但这些蛋白质如何调控肌球蛋白在肌丝域间的OFF-to-ON转变仍所知甚少。此外，收缩期间肌丝的应力是非均匀的，从肌丝末端向M线线性增加，这可能影响每个肌丝域内肌球蛋白的机械感知转变。

近期针对心肌粗肌丝的冷冻电镜(cryo-EM)重建揭示了C区内肌球蛋白、MyBP-C和肌联蛋白C型超重复序列的组织结构，显示MyBP-C的C端通过直接与马达相互作用稳定肌球蛋白的折叠-OFF构象，而其N端与重叠的细纹丝形成连接。这与我已提出的一致——MyBP-C对肌球蛋白OFF状态的稳定作用与ATP周转研究中C区内超松弛(SRX)肌球蛋白群体的富集相符。然而，缺乏MyBP-C且包含肌联蛋白D型超重复序列的D区结构尚不明确。X射线干涉研究提出粗肌丝不同调控区域对应不同的肌球蛋白构象，并提示收缩期间肌球蛋白马达从D区到C区再到P区的顺序激活。但现有荧光和X射线结构方法只能提供肌丝调控状态的系综平均测量，掩盖了肌丝调控的区域特异性差异。

为克服这些局限，研究人员开发了荧光偏振显微镜(Fluorescence Polarization Microscopy, FPM)方法，将更高的空间分辨率与分子取向敏感性相结合，以直接观察单个骨骼肌肌原纤维内细肌丝和粗肌丝的亚肌小节结构变化。利用肌球蛋白调节轻链(regulatory light chain, RLC)和肌钙蛋白C(troponin C, TnC)上的取向报告分子，研究人员研究了兔腰大肌(psoas muscle)肌原纤维的亚肌小节调控。

**主要关键技术方法**

本研究的主要技术方法是荧光偏振显微镜(FPM)，通过激发光路中的线性偏振器和图像分束器，在单根或2–3根肌原纤维束(长约100 μm，宽1–3 μm)上采集平行和垂直偏振的荧光图像。使用双功能罗丹明探针标记肌球蛋白RLC的E-螺旋(RLC-E探针，监测肌球蛋白OFF/ON构象)以及肌钙蛋白C(TnC)的N叶(TnC-C探针，监测肌钙蛋白调控头部取向)和C叶(TnC-E探针，监测IT臂取向)。样本取自成年(18周龄)新西兰白兔腰大肌。温度控制(12–30 °C)和渗透压缩剂Dextran T-500用于恢复生理肌丝晶格间距。理论框架包括结合点扩散函数(PSF)效应和10%非特异性结合比例的模型模拟，用于估算各肌丝区域（P、C、D区和A、I带）的取向序参数。

**研究结果**

* ***Mapping the Regulatory State of Thin and Thick Filaments in Relaxed Myofibrils.** * 在放松肌原纤维(17 °C, pCa=9)中，FPM显示粗肌丝上RLC探针的取向序参数^2>在中央区域(包括P区和C区)较高，在D区较低，表明肌球蛋白马达在粗肌丝中央区域采用更平行于肌丝轴的取向，即折叠-OFF马达富集。细纹丝上TnC探针的^2>沿细纹丝均匀，表明放松状态下肌钙蛋白构象均一。模型模拟确认了放松状态下P区和C区的^2>值高于D区。

* ***Thin Filaments Exhibit Distinct Regulatory States in the I- and A-Bands of the Sarcomere in Rigor Myofibrils.** * 在零应力、无钙的强直(rigor)条件下，RLC探针^2>在所有粗肌丝区域变为更负值，表示肌球蛋白马达与肌动蛋白结合后呈现更垂直的取向。FPM进一步揭示，TnC-C和TnC-E探针在A带的^2>值远低于I带，表明在肌丝重叠区内，rigor下肌球蛋白结合肌动蛋白诱导了肌钙蛋白的大幅结构变化，这些变化部分沿细纹丝传播至I带。加入钙离子(pCa=4.7)后，TnC-C探针的取向变化发生在整个细纹丝，而TnC-E探针的变化主要限于A带。

* ***The Folded-OFF State of Myosin Motors is Enriched in the C-Zone of the Thick Filament in Relaxed Myofibrils at Physiological Temperature and Lattice Spacing.** * 温度从12 °C升至30 °C使RLC探针^2>在整个粗肌丝增加，但在21 °C以上时C区的增加更显著，表明在近生理温度下C区折叠-OFF肌球蛋白比例最高。加入4% Dextran T-500恢复晶格间距后，C区^2>在每一温度下均显著高于P区和D区，提示恢复生理晶格间距特异性地增强了C区折叠-OFF马达群体，支持MyBP-C通过其N端与肌动蛋白、C端与肌球蛋白头部的相互作用稳定肌球蛋白OFF状态的假说。

* ***Stretch of Relaxed Myofibrils Partially Activates the Folded-OFF Myosin Motors in C- and D-Zones of the Thick Filament.** * 在近生理条件(30 °C, 4% Dextran)下拉伸放松肌原纤维。肌小节长度从2.2增至2.8 μm时被动张力小幅增加但不改变RLC和TnC探针取向。当肌小节长度增至3.3 μm时，肌联蛋白介导的被动张力升至150–200 kPa(约最大力的30%)，此时C区和D区的RLC探针^2>降低而P区不变，表明拉伸通过肌联蛋白连接的被动张力或C区MyBP-C连接的丧失诱导了C区和D区折叠-OFF马达的部分激活。

* ***Spatial Control of Thin- and Thick-Filament Activation in Calcium-Activated Myofibrils.** * 在最大钙激活(pCa=4.7, 30 °C)下，RLC探针^2>在所有粗肌丝区域显著降低并沿粗肌丝均匀，标志肌球蛋白马达全长从折叠状态释放；TnC探针^2>在A、I带均匀，表明细纹丝均一激活。在亚最大钙激活(pCa=6.6)下，力仅达最大力的约10%，RLC探针分布显示P区和C区的^2>高于D区，提示亚最大激活时P、C区肌球蛋白OFF状态更稳定而D区马达更易激活。使用肌球蛋白抑制剂Para-Nitro-Blebbistatin(PNB)的实验表明：TnC-C探针(肌钙蛋白调控头部)取向变化主要依赖钙离子结合TnC，而TnC-E探针(IT臂)取向变化约75%由肌球蛋白贡献。在最大钙激活伴随等长收缩时，TnC-E探针在I带和A带的取向变化幅度相近，表明收缩时A带启动的肌球蛋白依赖性结构变化通过力依赖机制传播至I带，确保细纹丝在肌小节全长协调激活。

**讨论与结论**

讨论部分总结，研究人员通过FPM在近生理条件下直接解析了肌小节内细肌丝与粗肌丝的调控状态。放松状态下，生理温度和晶格间距使肌球蛋白OFF状态在C区富集，提供MyBP-C通过N端与肌动蛋白、C端与肌球蛋白头部稳定OFF构型的原位证据。拉伸实验表明D区马达在较低应力下激活，C、P区稳定性更高，支持粗肌丝激活的区域顺序性。强直条件下的肌钙蛋白取向变化揭示了肌球蛋白结合驱动A带细纹丝激活，I带仅部分受影响。在生理等长收缩条件下，肌球蛋白依赖性结构变化沿细纹丝从A带传播至I带，确保负荷下的协调激活。

研究结论翻译：这些发现共同确立了FPM作为在近生理条件下可视化肌丝区域特异性调控转变的有力方法。通过证明细纹丝与粗肌丝的激活均呈现空间异质性和机械调控特性，本研究在亚肌小节层面定义了一种肌肉收缩的双肌丝调控范式，为研究肌肉功能、疾病及靶向治疗性调控提供了结构框架。