云芝(Trametes versicolor)漆酶(laccase)同步降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮及脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

《Frontiers in Nutrition》：Simultaneous degradation of aflatoxin B1, zearalenone, and deoxynivalenol by Trametes versicolor laccases

　　

背景：谷物中多种霉菌毒素(mycotoxin)共污染对食品质量与安全构成重大挑战，亟需能够同步降解多种霉菌毒素的解毒方法。本研究探讨云芝(Trametes versicolor)漆酶(laccase, EC 1.10.3.2)作为生物催化剂同步降解黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)及脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)的潜力。方法：研究人员采用单因素试验及响应面法(response surface methodology, RSM)优化Tv-1菌株液态发酵(submerged fermentation, SmF)产漆酶条件；经硫酸铵分级沉淀、透析及阴离子交换色谱纯化漆酶，分析其最适温度、pH、热稳定性及pH稳定性以确定适宜解毒条件。结果：发酵液漆酶活性于28℃、初始pH 5.4、装液量105 mL条件下发酵7.9 d达最高6843.14 U/L；漆酶最适温度为50℃、最适pH为4.5，综合考虑稳定性选用30℃和pH 4.5进行解毒实验；使用脱盐漆酶制剂S3，在无介体(mediator-free)条件下可同步降解AFB1、ZEN和DON，降解率分别为32.88%、91.88%和54.45%。结论：云芝漆酶可作为无介体环境友好型生物催化剂用于三种主要霉菌毒素的同步降解，但较高初始毒素浓度及多毒素共存会降低降解效率，实际应用仍需进一步优化。

本文对发表于《Frontiers in Nutrition》的论文《Simultaneous degradation of aflatoxin B₁, zearalenone, and deoxynivalenol by Trametes versicolor laccases》进行解读总结。

研究背景与目的

谷物等主食商品常受黄曲霉毒素B₁（AFB₁）、玉米赤霉烯酮（ZEN）及脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等多种霉菌毒素(mycotoxin)共污染，传统物理吸附、化学处理存在去除不完全、营养损失及化学残留等问题。生物酶解毒因条件温和、专一性强具应用前景，但已报道的酶大多底物谱窄，且多数研究局限于单一毒素体系，缺乏单一酶在无介体(mediator-free)条件下同步降解上述三种主要霉菌毒素的报道。研究人员以高产漆酶(laccase, EC 1.10.3.2)的药食兼用云芝(Trametes versicolor)菌株Tv-1为对象，通过优化发酵、分离纯化漆酶、表征酶学性质，系统考察其对AFB₁、ZEN和DON单独及混合体系中的降解能力，旨在开发绿色、低温、无介体的多霉菌毒素同步解毒策略。

主要关键技术方法

研究人员从保藏中心获取T. versicolor菌株Tv-1，通过单因素实验结合Box–Behnken响应面法(RSM)优化液态发酵(SmF)产漆酶条件（发酵时间、初始pH、装液量）；发酵液离心过滤后经20%～70%(NH₄)₂SO₄分级沉淀、磷酸盐缓冲液(PB)溶解、8000–14000 Da截留分子量透析袋透析除盐浓缩得到脱盐漆酶制剂S3；取部分S3经DEAE-Sepharose 6 FF阴离子交换色谱分离获得两个漆酶同工酶LacA和LacB；采用愈创木酚(guaiacol)比色法测定漆酶活性，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)进行蛋白鉴定；以高效液相色谱(HPLC)按中国国标方法定量三种霉菌毒素残余量并计算降解率；在30℃、pH 4.5（琥珀酸-氢氧化钠缓冲液）无介体条件下分别进行单毒素及三毒素共存降解实验，设热灭活酶为对照；数据采用Design-Expert、SPSS及Origin软件分析。

研究结果

3.1 Effects of culture conditions on laccase production by T. versicolor

单因素实验表明：漆酶活随发酵时间延长至第8 d达峰值后下降；28℃时产酶最高；初始培养基pH 5.5时最佳；250 mL摇瓶装液量100 mL时产酶最高。由此选取发酵时间(X₁: 6–10 d)、初始pH(X₂: 4.5–6.5)、装液量(X₃: 70–130 mL)进行RSM优化。

3.2 Box–Behnken optimization and model validation of laccase production

建立的二次回归模型显著(p < 0.0001)，失拟项不显著(p = 0.2136)，R²=0.9960，预测可靠性高。各变量影响程度为装液量 > 初始pH > 发酵时间，交互项不显著。模型预测最优条件为发酵7.9 d、初始pH 5.41、装液量104.47 mL，修正为7.9 d、pH 5.4、105 mL验证实验，实测漆酶活性6843.14 ± 34.96 U/L，与预测值(6818.73 U/L)吻合良好。

3.3 Purification of T. versicolor laccase and electrophoretic analysis

(NH₄)₂SO₄分级沉淀确定50%为一级除杂饱和度、70%为二级沉淀饱和度收集漆酶。经透析浓缩得S3（比活10.51 U/mg，回收率69%）。DEAE-Sepharose 6 FF洗脱出现两个活性峰：先流出为LacA（低亲和力），0.2 mol/L NaCl洗脱为LacB（强结合）。SDS-PAGE显示LacA和LacB为单带，分子质量分别约为62.87 kDa和54.12 kDa；Native-PAGE愈创木酚显色证实二者均具漆酶活性。纯化表中LacA比活33.07 U/mg（纯化倍数5.0倍，回收6%），LacB比活13.47 U/mg（纯化倍数2.04倍，回收2%）。

3.4 Optimum temperature and pH, and stability of T. versicolor laccase

S1粗酶液、LacA及LacB最适反应温度均为50℃，最适反应pH均为4.5。热稳定性：30℃下12 h内三者均保持稳定；40℃时S1和LacB活性损失<8%，LacA损失>24%；50–60℃迅速失活。pH稳定性：pH 3.0–7.0孵育24 h后相对活性均>71%，其中LacA耐酸性最好（>89%）。鉴于30℃兼具良好稳定性与足够催化活性，选定30℃和pH 4.5为降解反应条件。

3.5 Degradation of AFB₁, ZEN, and DON by T. versicolor laccase

单毒素降解实验中，降解率随时间延长而升高，随初始毒素浓度升高而降低（受酶饱和及有机溶剂影响）。热灭活S3无降解作用，证实降解系漆酶催化的酶促反应。三毒素共存同步降解实验中，AFB₁（50 ng/mL）、ZEN（300 ng/mL）、DON（2000 ng/mL）于30℃、pH 4.5、216 h后降解率分别为32.88%、91.88%、54.45%，192 h后趋于平台期；共存体系中各毒素降解率低于单独处理，提示存在底物竞争或相互干扰。

讨论与结论翻译

研究人员通过单因素实验和响应面法(RSM)系统优化了云芝(T. versicolor)菌株Tv-1产漆酶的发酵条件。经下游分离纯化，SDS-PAGE和Native-PAGE分析确认Tv-1分泌两种漆酶同工酶LacA和LacB。酶学性质表征确定了漆酶的最适温度和pH及其热稳定性和pH稳定性，综合考虑酶稳定性与催化性能，确定30℃和pH 4.5为适宜的霉菌毒素降解条件。在此条件下，该漆酶可分别降解单一霉菌毒素（AFB₁、ZEN和DON），也能在混合体系中同步降解三种毒素。值得注意的是，较高的初始霉菌毒素浓度及多霉菌毒素共存会降低降解效率，提示实际应用时需解决此局限。总之，源自云芝的天然漆酶为多种霉菌毒素同步降解提供了一种可持续、低温且无介体(mediator-free)的策略。未来工作应聚焦于阐明高浓度及多毒素共存下降解效率降低的机制、明确LacA和LacB各自对霉菌毒素降解的贡献、鉴定转化产物并评估其残留毒性、在实际食品/饲料基质中验证性能，以及通过基因克隆异源表达和酶工程改造提升催化效率与鲁棒性，推动工业化应用。