基于时间分辨单细胞图谱揭示动态细胞异质性：猪肠类器官作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮体外评估模型的应用

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Dynamic cellular heterogeneity revealed through a time-resolved single-cell atlas: assessment of porcine intestinal organoids as an in vitro model for deoxynivalenol and zearalenone

　　

肠上皮细胞由动态细胞异质性支持，这对维持肠道稳态至关重要。近年来，肠类器官模型因其能够复现小肠的结构、功能和细胞复杂性而受到关注，成为重要的体外研究平台。研究人员建立了猪肠类器官，并利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）研究了其时间依赖性转录组变化。此外，为评估该类器官作为体外毒性模型的适用性，研究人员将其暴露于霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEA）。建立的类器官可稳定长期培养至第10代（32天），并在十二指肠、空肠和回肠三个区域与天然小肠组织表现出高度遗传相似性。在类器官中鉴定出多种肠上皮细胞类型，包括增殖中的 transit-amplifying（TA）细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、帕内特细胞及其他上皮细胞类型。scRNA-seq将类器官分为多个 distinct 细胞群，包括干细胞、TA细胞、分泌型祖细胞、肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞和帕内特细胞，展示了动态细胞异质性。类器官还复现了关键肠道功能，如营养吸收和上皮屏障形成，与天然小肠上皮相似。在此条件下，评估了DON和ZEA的细胞毒性效应。这些霉菌毒素处理导致细胞活力降低、肠道屏障功能受损，以及增殖和分化速率改变，包括肠内分泌细胞、杯状细胞和帕内特细胞群体。该研究通过scRNA-seq分析时间特异性类器官，为小肠上皮细胞的生长和分化提供了基础认识。此外，其在接近小肠真实环境的条件下评估了霉菌毒素毒性，比现有体外模型提供了更具生理学相关性的数据，可作为可靠的毒性评估模型。

小肠上皮细胞具有显著的可塑性，通过肠干细胞（intestinal stem cells, ISCs）沿隐窝-绒毛轴驱动自我更新、增殖、分化和去分化过程。隐窝中的ISCs受微环境信号严格调控，控制其自我更新及向吸收型和分泌型细胞类型的分化。小肠上皮由单层细胞构成，通过紧密连接、黏附连接和缝隙连接等特化细胞间连接紧密连接，维持组织完整性并调控旁细胞通透性。该上皮结构在高效摄取营养的同时，作为抵御有害抗原和病原体的保护屏障。在养猪产业中，霉菌毒素是造成重大经济损失的主要有害因素。霉菌毒素是真菌产生的次生代谢产物，全球广泛分布，尤其存在于玉米、小麦、大麦和燕麦等谷物 derived 饲料中。其中，由镰刀菌属产生的ZEA和DON在动物饲料中检出率最高。这些毒素首先接触小肠上皮并迅速被吸收。猪对DON最敏感，摄入后诱导炎症、破坏肠黏膜屏障、损害营养吸收并增加机会性感染风险。ZEA则破坏肠道结构和功能，诱导炎症、氧化应激和激素失衡。

肠类由ISCs生成，形成三维培养体系，复现小肠隐窝-绒毛结构。这些系统表现出自我更新、自组织及多谱系分化为干细胞、TA细胞、肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞和帕内特细胞等上皮细胞群的基本生物学特性。鉴于其在细胞异质性、可塑性和结构组织方面与天然小肠的相似性，肠类器官在包括牛、猪和鸡模型在内的农场动物研究中日益受到关注，已广泛应用于毒性、病毒感染和疾病发病机制等体外研究。然而，尽管其具有显著可塑性，现有研究多限于 characterization，尚需进一步研究以考察其对猪肠类器官中多种细胞类型的影响。scRNA-seq作为强大的新兴工具，可用于研究细胞异质性、重建转录轨迹和探索肿瘤个体性。小肠上皮包含多种细胞类型，批量RNA测序无法充分 capture 其细胞异质性；而scRNA-seq可在单细胞水平进行转录组分析，因而非常适合准确表征肠上皮细胞的异质性。但scRNA-seq尚未应用于 livestock 小肠类器官研究，大多数研究聚焦于细胞类型 characterization、二维培养系统对肠道功能的适用性评估，以及病毒感染模型的影响。

该研究旨在评估建立的猪肠类器官是否复现天然小肠的时间发育特征，并表征其动态细胞异质性。研究人员进一步确认这些类器官表现出小肠上皮的关键特征，包括营养摄取功能（葡萄糖、氨基酸和脂肪酸）和肠道屏障完整性。此外，研究人员评估了DON和ZEA对细胞毒性、增殖速率以及向肠内分泌细胞、杯状细胞和帕内特细胞分化的影响。研究发现这些类器官的生长和分化动态与天然小肠上皮细胞相当，反映了体内肠道生理的关键方面。鉴于其高生物学相关性，这些类器官代表了一种强大的体外模型，可用于毒性、细胞分化和肠道疾病研究。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：从三元杂交母猪（长白×约克夏×杜洛克）获取小肠隐窝建立猪肠类器官培养体系；利用scRNA-seq技术（10x Genomics Chromium平台）对空肠来源类器官培养1、3、5天进行单细胞转录组测序，结合Seurat和Monocle2进行生物信息学分析；通过LDH法和EdU掺入实验分别评估细胞活力和增殖；利用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖（4 kDa）渗透性实验及ZO-1免疫荧光检测评价肠道屏障功能；采用BPA探针、葡萄糖摄取探针及BODIPY标记分别检测氨基酸、葡萄糖和脂肪酸摄取能力；借助流式细胞术定量分析CHGA、MUC2和LYZ阳性细胞比例；使用膜联蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）双染区分细胞凋亡与坏死阶段。

研究结果部分，"猪肠类器官的发育与表征"显示：从十二指肠、空肠和回肠分离的ISCs可稳定培养至第10代（32天），形成隐窝-绒毛样结构。qPCR和免疫荧光证实类器官包含LGR5⁺干细胞、KI67⁺增殖细胞、CHGA⁺肠内分泌细胞、MUC2⁺杯状细胞、LYZ⁺帕内特细胞及ZO-1⁺上皮细胞，与对应区域天然小肠组织具有相似的细胞异质性，但十二指肠来源类器官中CHGA表达显著低于天然组织，回肠来源类器官中SI和CHGA表达降低。

"猪肠类器官的细胞聚类分析"表明：scRNA-seq获得15,317个高质量细胞，UMAP可视化显示不同培养时间细胞群体分布变化。基于特征基因表达将细胞注释为9群：干细胞（OLFM4⁺、LGR5⁺、ASCL2⁺）、TA细胞（PCNA⁺）、分泌型祖细胞（DLL1⁺）、肠上皮细胞（FABP2⁺、ALDOB⁺）、杯状细胞（MUC2⁺、AGR2⁺）、肠内分泌细胞（CHGA⁺）、帕内特细胞（MMP7⁺）、微褶细胞（HCK⁺）及干细胞/TA过渡群体。

"单细胞转录组揭示肠上皮细胞的动态成熟与谱系进展"显示：随培养时间延长，分化细胞类型比例逐渐增加。第3天时，生长信号（DLL1、DLL4、GUCA2A、GUCA2B）、肠内分泌分化因子（NEUROG3、ARX、PAX4、ISL1、FOXA1、FOXA2、PROX1、RFX6）和杯状细胞分化因子（SPDEF、KLF4、GFI1）普遍上调，而干性标志物AXIN2、CD44、BMI1在第1天表达更高。Monocle2伪时序分析显示，第3天从干系向肠内分泌和杯状细胞谱系的分化轨迹最为显著，GO和KEGG分析进一步支持了分化相关的功能和通路富集。

"猪肠类器官小肠功能评估"表明：通过EDTA处理成功建立 apical-out 类器官，ZO-1免疫荧光证实其极性转换。FITC-dextran渗透实验显示基础和 apical-out 类器官均具有完整屏障功能。营养吸收实验中， apical-out 类器官对氨基酸、葡萄糖和脂肪酸的摄取效率均高于 basal-out 类器官，且 apical-out 结构表达 apical 定位的氨肽酶N（ANPEP），支持其作为感染模型的潜力。

"DON和ZEA的细胞毒性评估"显示：DON和ZEA的半数抑制浓度分别约为2 μmol/L和80 μg/mL。处理后的类器官隐窝-绒毛结构破坏，直径显著减小，EdU⁺增殖细胞比例降低。Annexin V/PI染色显示，对照组早期凋亡率为0.86% ± 0.05%，而DON和ZEA处理组分别升至8.60% ± 0.59%和6.31% ± 1.49%；晚期凋亡和坏死比例也显著增加，表明两种毒素均通过降低干性、增加细胞死亡导致肠道结构和功能障碍。

"DON和ZEA处理后肠道屏障功能评估"表明：基础和 apical-out 类器官中，DON和ZEA处理均导致FITC-dextran向管腔渗透增加。免疫荧光显示对照组ZO-1沿 apical 膜连续表达，而毒素处理组呈不连续分布，证实类器官模型适用于评估DON和ZEA诱导的肠道屏障损伤。

"DON和ZEA对肠上皮细胞分化的影响"显示：免疫荧光和流式细胞术定量表明，DON和ZEA显著减少CHGA⁺肠内分泌细胞（对照2.03% ± 0.09% vs. DON 0.99% ± 0.36% vs. ZEA 0.80% ± 0.32%）和MUC2⁺杯状细胞（对照5.69% ± 0.46% vs. DON 2.78% ± 0.68% vs. ZEA 1.91% ± 0.11%）比例。LYZ⁺帕内特细胞在DON处理后无显著变化，但ZEA处理后比例增加。

讨论部分，研究人员指出小肠上皮由ISCs、TA细胞、祖细胞、肠上皮细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞、帕内特细胞和微褶细胞等多样细胞类型组成，这些细胞群之间的复杂相互作用对维持肠道稳态至关重要。3D类器官技术已在 livestock 中发展起来，模拟隐窝-绒毛结构并包含多种上皮细胞类型。维持其结构特征和细胞异质性需要多种生长因子和小分子，包括noggin、R-spondin、WNT3A、p38抑制剂、GSK3β抑制剂、EGF、烟酰胺、ALK5抑制剂和ROCK抑制剂等。该研究利用有限组合（WNT3A、R-spondin 3、noggin、EGF、ALK5抑制剂和ROCK抑制剂）成功建立猪肠类器官。既往研究表明，GSK3β抑制剂可抑制凋亡和神经分化并增大家禽肠类器官；烟酰胺和p38抑制剂则促进肠上皮细胞增殖但抑制杯状和肠内分泌细胞分化，这可能解释十二指肠来源类器官中CHGA降低及回肠来源类器官中SI和CHGA表达下降的现象。但空肠来源类器官与天然组织无显著差异。总体而言，建立的类器官包含多种上皮细胞类型，可长期培养，且该毒性模型有助于更清晰解读p38、GSK和烟酰胺在细胞信号和毒性反应中的作用。

scRNA-seq为理解细胞行为和谱系分化机制提供了新视角。此前scRNA-seq在猪小肠的应用揭示了品种特异性免疫分化及断奶相关病理生理变化，但在小肠类器官研究中应用有限。该研究结果证实，建立的类器官包含多种上皮细胞类型，模拟了肠道生长和分化的时间模式，不同时间点的基因表达变化得到确认。DON和ZEA是饲料原料中最常检出且常共存的霉菌毒素。既往研究表明DON诱导免疫反应、抑制蛋白质合成、上调炎症因子、破坏肠道屏障并触发凋亡；ZEA则导致DNA损伤、氧化应激和炎症，引发生长性能受损。DON通过激活p38和c-Jun破坏肠道屏障功能，并激活Wnt通路中的GSK3β抑制猪 enteroids 干性。该研究与此一致，发现DON和ZEA降低细胞活力、改变隐窝-绒毛结构、减少增殖细胞并破坏肠道屏障。由于L-WRN培养基含ROCK抑制剂以抑制caspase依赖性凋亡支持长期培养，DON和ZEA诱导的凋亡率相对于细胞活力降低呈较低趋势，可能归因于ROCK抑制剂的保护作用。ZO-1作为紧密连接蛋白的代表，其丢失及其他成分如occludin的缺失均足以增加肠道通透性。紧密连接蛋白的细胞定位与肠道屏障功能密切相关，肿瘤进展、上皮-间质转化和炎症可诱导其定位改变，最终导致屏障功能破坏。该研究观察到DON和ZEA处理组ZO-1表达不规则。然而，紧密连接的分子调控机制尚不完全清楚，需进一步研究阐明霉菌毒素诱导肠道屏障破坏的机制。营养吸收评估显示 apical-out 类器官吸收效率高于 basal-out 类器官，但因毒素处理后旁细胞通透性增加使营养类似物进入管腔，该工具无法直接比较毒素处理后的吸收效率，这是体外模型的局限。

小肠上皮包含多种分泌细胞类型，其中杯状细胞是最常见的分泌细胞，通过形成黏液层保护抵御外部抗原，并为抗菌肽提供微环境；帕内特细胞分泌Wnt和Notch配体维持ISCs干性并产生抗菌肽；肠内分泌细胞则分泌调节食欲、肠黏膜生长、营养感知与吸收、葡萄糖代谢、增殖和运动的激素。尽管这些细胞在小肠中至关重要，DON和ZEA对猪小肠类器官分泌细胞类型影响的研究仍然有限。该研究发现DON和ZEA减少肠内分泌和杯状细胞分化，DON不影响帕内特细胞比例，而ZEA诱导帕内特细胞增加。这与前人发现DON和ZEA与人类和小鼠杯状细胞数量减少相关的研究一致。肠内分泌和帕内特细胞在小肠中极为稀少，其在 livestock 分化的研究有限。此外，肠上皮细胞间相互作用高度复杂，涉及细胞可塑性和去分化等过程，有待进一步研究。该研究中ZEA诱导帕内特细胞增加可能至少部分反映了对急性毒性的适应性或保护性反应。

研究结论部分翻译：该研究建立了猪肠类器官，并表征了所有主要类型的肠上皮细胞。此外，在不同时间点确认了与生长和分化相关基因的表达模式。基于这些数据，确认建立的类器官培养基适用于猪肠类器官培养，无需额外添加小分子物质。此外，类器官复现了包括内部屏障形成和营养摄取在内的基本肠道功能。利用该模型，研究人员检查了DON和ZEA对类器官生长、增殖、肠道屏障功能和分化的细胞毒性效应。该模型可应用于评估有害因素对猪生产性能的细胞毒性，是研究疾病、分化和发育的有吸引力的体外模型。此外，它提供了动物实验的替代方案，支持动物福利。该论文发表于《Journal of Animal Science and Biotechnology》。