髓系细胞中EGFR缺失重编程结直肠癌免疫抑制微环境

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：EGFR deletion in myeloid cells reprograms the immunosuppressive landscape of colorectal cancer

　　

尽管转移性结直肠癌(metastrocytes colorectal cancer, mCRC)的治疗已取得进展，它仍是癌症相关死亡的第二大原因，有效治疗手段有限。虽然EGFR(epidermal growth factor receptor)抑制是无KRAS突变mCRC患者标准的一线疗法，但常发生耐药而限制临床获益。小鼠CRC模型显示髓系细胞EGFR缺失可减少肿瘤负荷，且EGFR阳性髓系细胞与mCRC患者不良预后相关，但其对抗EGFR疗法疗效反应中的作用仍不清楚。本研究整合小鼠模型、单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)、蛋白质组学及患者来源mCRC数据集，探究髓系细胞EGFR信号如何塑造肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)。在临床前治疗试验中，研究人员证实荷CRC瘤小鼠髓系细胞EGFR缺失可减缓肿瘤生长，而仅肠上皮肿瘤细胞EGFR缺失无治疗效果。EGFR缺失还降低了F4/80hi巨噬细胞（尤其是Spp1+和C1qc+亚群）丰度，并降低髓系细胞中TGFβ(transforming growth factor β)、IFNγ(interferon γ)和JAK/STAT等炎症通路活性。这些变化改变了髓系细胞-T细胞互作，导致以免疫检查点分子表达降低为特征的低免疫抑制性TME。此外，研究人员鉴定出血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1, THBS1)为髓系来源并与T细胞互作的配体，并通过蛋白质组学分析确认其受EGFR信号调控。人CRC数据集分析显示，高表达EGFR和THBS1与患者不良预后相关。综上，这些发现确立髓系细胞EGFR信号是免疫抑制性TME的关键调控因子，提示靶向特定髓系细胞亚群的EGFR可能是mCRC有前景的治疗策略。

论文解读：髓系细胞中EGFR缺失重编程结直肠癌免疫抑制微环境

研究背景与立项依据

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是癌症相关死亡的第二大常见原因，转移性CRC(metastatic CRC, mCRC)尤甚。目前野生型KRAS/BRAF的mCRC患者采用化疗联合抗EGFR(epidermal growth factor receptor)单抗一线治疗，但相当比例患者无效或产生耐药，且总EGFR表达量无法预测疗效。既往研究表明，髓系细胞（而非肿瘤细胞）表达的EGFR具有促CRC肿瘤发生作用，且EGFR阳性髓系细胞与mCRC患者不良预后相关，但髓系细胞EGFR信号如何调控肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)组成及细胞间互作、是否介导抗EGFR治疗疗效尚不明确。本研究旨在探究髓系细胞EGFR信号对CRC免疫抑制微环境的重塑作用及潜在治疗价值。

主要关键技术方法

研究人员采用AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌小鼠模型，构建LysM-CreER^T2介导的可诱导髓系细胞Egfr敲除(Egfr^ΔMyl-ER)及组成型敲除(Egfr^ΔMyl)、CD11c-Cre介导的树突状细胞特异性Egfr敲除模型，并设Egfr^fl/fl对照；对肿瘤组织进行流式细胞术(flow cytometry)及多重免疫荧光(multiplex immunofluorescence)分析免疫细胞浸润；分选CD45⁺和CD45^-细胞进行10x Genomics单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)，利用Seurat进行细胞分型，PROGENy/decoupleR评估通路活性，CellChat和iTalk预测细胞-细胞通讯(cell-cell communication)，limma进行差异表达分析，GSVA(gene set variation analysis)进行通路富集；分选粒细胞、单核细胞及巨噬细胞进行纳米流式质谱(nano-flow mass spectrometry)蛋白质组学分析；利用已发表人CRC scRNA-seq数据集(GSE132465)及大样本转录组队列(GSE39582, n=516)验证髓系EGFR活性及相关基因表达，并进行生存分析(Kaplan-Meier, log-rank检验, Cox回归及随机效应荟萃分析meta-analysis)；对人CRC组织进行多重免疫荧光及空间分子成像(spatial molecular imaging, CosMx SMI)验证蛋白共表达。

研究结果

EGFR deletion in myeloid cells of established CRC leads to reduced tumor burden（已建立CRC中髓系细胞EGFR缺失导致肿瘤负荷降低）

通过AOM/DSS模型及他莫昔芬诱导Egfr^ΔMyl-ER小鼠，证实已形成的结直肠肿瘤经髓系细胞Egfr删除后肿瘤面积显著缩小（肿瘤数目不变），而肠上皮细胞Egfr缺失无影响；CD11c-Cre介导的树突状细胞Egfr缺失亦不改变肿瘤负荷，排除树突状细胞作用。流式及免疫荧光显示Egfr^ΔMyl和Egfr^ΔMyl-ER肿瘤中F4/80^hi巨噬细胞及Ly6C^hi单核细胞数量减少，粒细胞、F4/80^lo髓系细胞及cDC1(conventional DC1)比例不变。结论：髓系细胞（主要是巨噬细胞/单核细胞）而非树突状细胞的EGFR信号促进已建立CRC肿瘤生长及早期肿瘤起始。

Single-cell transcriptomics reveals an altered colorectal TME upon EGFR deletion in myeloid cells（单细胞转录组学揭示髓系细胞EGFR缺失后结直肠TME发生改变）

对Egfr^fl/fl和Egfr^ΔMyl肿瘤CD45⁺/CD45^-细胞进行scRNA-seq，无偏聚类得到22个细胞簇，包括C1qc⁺巨噬细胞、Spp1⁺巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、T/B细胞、上皮细胞及成纤维细胞等。Egfr^ΔMyl肿瘤中粒细胞和巨噬细胞比例下降，T细胞和B细胞比例上升。因scRNA-seq中Egfr mRNA检出率低，用PROGENy评估EGFR通路活性，发现小鼠及人CRC数据中SPP1⁺巨噬细胞和炎性巨噬细胞EGFR通路活性最高。结论：髓系细胞EGFR缺失使TME向免疫细胞浸润增加、巨噬细胞/粒细胞减少的方向偏移，且EGFR信号在促肿瘤的SPP1⁺巨噬细胞中尤为活跃。

Impaired signaling in myeloid cells lacking EGFR（缺乏EGFR的髓系细胞中信号通路受损）

对髓系细胞亚群再聚类分析显示Egfr^ΔMyl各髓系亚群相对比例不变。GSVA及PROGENy分析表明Egfr缺失后Spp1⁺和C1qc⁺巨噬细胞中PI3K和JAK/STAT通路活性下调，TGFβ、IFNγ、IL6、IL1等炎症相关通路也下调，迁移及有丝分裂通路下调；Chil3⁺单核细胞吞噬相关基因上调。差异表达分析显示C1qc⁺巨噬细胞Il1a/b、Cxcl2/3、S100a8/9、Thbs1及Cd274(PD-L1)下调，Spp1⁺巨噬细胞Cd86和Msr1下调，两群巨噬细胞Ccr1、Lilrb4a及JAK/STAT通路组分均下调。结论：髓系细胞EGFR信号通过激活PI3K/JAK-STAT及炎症通路维持促肿瘤巨噬细胞表型、招募及免疫抑制分子表达。

EGFR deletion in myeloid cells reduces immunosuppression in CRC（髓系细胞EGFR缺失降低CRC中免疫抑制）

T细胞亚群再聚类鉴定出9个簇，Egfr^ΔMyl肿瘤中Foxp3⁺Ctla4⁺T_regs(regulatory T cells)及记忆T细胞比例降低，初始样T细胞比例升高，PD-1⁺(Pdcd1⁺)耗竭CD8⁺T细胞减少，流式验证T_reg比例下降。差异表达显示CD4⁺和CD8⁺T细胞中Ctla4、Pdcd1、Lilrb4、Havcr2(TIM-3)等耗竭/抑制分子下调，Sell、Tcf7、Lef1等初始/组织驻留标志上调。结论：髓系细胞EGFR缺失通过减少抑制性髓系细胞及降低免疫检查点/耗竭分子表达，使TME由免疫抑制向免疫活化偏移。

Predicted cell-cell communication networks are altered between myeloid cells and T cells in CRC of Egfr^ΔMylmice（Egfr^ΔMyl小鼠CRC中髓系细胞与T细胞间预测的胞-胞通讯网络发生改变）

CellChat和iTalk分析显示Egfr^fl/fl肿瘤中髓系→T细胞的抑制性互作（THBS1-CD47/ITGB1/ITGA4、CD274-PDCD1、CD80/86-CTLA4、CCL6-CCR2等）概率高；Egfr^ΔMyl肿瘤中上述抑制性配体-受体互作概率显著降低，MHC-I(T细胞活化相关)互作概率升高。结论：髓系细胞EGFR信号通过上调THBS1等抑制性配体及免疫检查点配体促进髓系-T细胞间的免疫抑制性串扰。

Integration of proteomic data with single-cell transcriptomics of myeloid cells reveals common targets in macrophages（髓系细胞蛋白质组与scRNA-seq整合分析揭示巨噬细胞共有靶标）

分选巨噬细胞等进行质谱蛋白质组学，Egfr^ΔMyl巨噬细胞中THBS1、THBS4及胰岛素信号/凝血相关蛋白下调，抗原摄取加工相关蛋白(LAMP2, ITGAM, PSME1)上调。THBS1和PLEK在mRNA和蛋白水平均下调，免疫荧光证实肿瘤相关巨噬细胞共表达EGFR和THBS1。结论：EGFR信号在蛋白水平调控巨噬细胞THBS1表达，THBS1是髓系EGFR信号的下游效应分子及潜在髓系-T细胞抑制性配体。

The EGFR pathway is active in inflammatory and SPP1⁺myeloid cells in human CRC（人CRC中EGFR通路在炎性及SPP1⁺髓系细胞中具活性）

人CRC scRNA-seq数据显示炎性及SPP1⁺巨噬细胞EGFR通路活性最高；按EGFR活性高低分群，EGFR^low人巨噬细胞IL1A/B、IL6、CXCL2、THBS1、S100A8/9及AREG/EREG(EGFR配体)下调，与小鼠数据一致。516例CRC患者生存分析显示高THBS1或高EGFR分别与较差总生存(overall survival, OS)相关，二者共高预后更差；C1qc⁺、Spp1⁺巨噬细胞特征基因高表达及与高EGFR/THBS1共表达均与较差OS相关，且为独立不良预后因素（尤以Spp1⁺三重高特征在III期具不良预后价值）。人CRC组织多重免疫荧光及空间转录组证实CD68⁺C1QC⁺巨噬细胞共表达EGFR、THBS1、SPP1。结论：小鼠发现可转化至人CRC，髓系EGFR活性及THBS1是不良预后指标。

讨论与结论总结（翻译研究结论部分）

本研究表明髓系细胞中的EGFR信号塑造其表型并影响CRC TME整体组成。通过对髓系细胞条件性Egfr缺失小鼠肿瘤进行无偏scRNA-seq分析，研究人员证明免疫浸润改变及TME免疫抑制减弱，伴有髓系细胞炎症信号通路活化降低，影响其与T细胞通讯。重要的是，研究人员鉴定出髓系来源的Thbs1是受EGFR信号调控的介质，并强调其在人CRC生存中的预后作用。临床前研究证明已形成的结直肠肿瘤中髓系细胞Egfr缺失可导致肿瘤体积缩小。这些发现强烈提示靶向髓系细胞（特别是SPP1⁺/C1QC⁺肿瘤相关巨噬细胞）中的EGFR可能使CRC患者获得显著治疗获益。此外，高表达EGFR、THBS1及C1qc⁺/Spp1⁺巨噬细胞特征与人CRC不良生存密切相关，支持以髓系EGFR-THBS1轴作为患者分层生物标志物及潜在治疗靶点。