《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：A human telomerase reverse transcriptase-derived peptide GV1001 rescues neurodegeneration in a mouse model of Alzheimer disease
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GV1001是一种由人端粒酶逆转录酶催化亚基衍生的16个氨基酸组成的肽。近期针对阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）患者的II期临床试验表明，GV1001在证明安全性的同时能有效改善记忆障碍，从而推动了更大规模的临床试验。然而，GV100
GV1001是一种由人端粒酶逆转录酶催化亚基衍生的16个氨基酸组成的肽。近期针对阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）患者的II期临床试验表明，GV1001在证明安全性的同时能有效改善记忆障碍，从而推动了更大规模的临床试验。然而，GV1001治疗AD的作用机制尚不明确。在此，研究人员报告，GV1001通过增加小胶质细胞向大淀粉样斑块（amyloid plaque）的迁移和淀粉样β（amyloid beta, Aβ）的降解，减少5xFAD小鼠的淀粉样斑块负荷，并挽救突触丢失和记忆缺陷。单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）显示，GV1001通过调节疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）谱系，促进迁移和吞噬表型。在分子水平上，通过虚拟靶点筛选和对接模拟结合肽拉下实验（peptide pulldown assay），研究人员确定缓激肽受体1（bradykinin receptor 1, B1R）是GV1001的结合靶点。此外，研究人员揭示，GV1001以哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mammalian target of rapamycin complex 2, mTORC2）依赖性方式促进小胶质细胞迁移和Aβ吞噬。综上所述，本研究证明了GV1001在小胶质细胞中的淀粉样蛋白溶解作用及其相关的深入信号机制，表明GV1001是AD的一种有前景的疾病修饰治疗药物。
阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）作为最常见的与年龄相关的神经退行性疾病，其病理特征为聚集的淀粉样β（amyloid beta, Aβ）沉积和细胞内神经原纤维缠结。根据淀粉样蛋白假说，Aβ的过度产生和积累在AD发病机制中起关键作用，伴随突触和神经元丢失及进行性认知下降。尽管多项全基因组关联分析揭示了小胶质细胞在AD遗传风险中的核心地位，且小胶质细胞具有吞噬Aβ的保护潜力，但促炎性激活会抑制其吞噬功能，导致Aβ清除受损和神经毒性炎症介质过量产生，从而加剧神经退行性病变。由于小胶质细胞激活具有双面性，且现有针对Aβ的疗法存在安全性或疗效局限性，寻找能恢复小胶质细胞正常功能、调节其表型以清除Aβ的新型治疗策略显得尤为迫切。GV1001作为一种源自人端粒酶逆转录酶的肽，此前在癌症免疫治疗中展现出安全性，近期II期临床试验显示其能改善中重度AD患者的认知功能。鉴于其临床前景及作用机制不明，研究人员旨在阐明GV1001对AD模型小鼠神经退行性病变的修饰机制，特别是其对小胶质细胞谱系及信号通路的影响，以期为AD的疾病修饰治疗提供理论依据。本研究发表于《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》。
为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，采用5xFAD转基因小鼠作为AD疾病模型，并通过立体定位注射或腹腔注射给予GV1001及特异性抑制剂进行体内干预；其次，利用行为学测试（如旷场实验、新物体识别实验、Y迷宫实验）及组织化学染色（如Golgi-Cox染色、免疫荧光染色）评估认知功能、突触完整性和淀粉样斑块负荷；第三，结合虚拟靶点筛选（Ligand-based virtual target screening, LBVS）、分子对接模拟（Peptide-protein docking simulation）以及生物素标记肽拉下实验（Biotin-streptavidin pulldown assay）从计算生物学到生化层面鉴定GV1001的分子靶点；第四，通过原代小胶质细胞和星形胶质细胞的体外培养，结合Transwell迁移实验、吞噬实验及Western blot检测信号通路激活情况；最后，利用单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）技术对小鼠大脑皮层细胞进行转录组分析，解析GV1001处理后不同细胞类型尤其是小胶质细胞亚群（如DAM1, DAM2）的基因表达变化及轨迹分析。
研究结果显示，GV1001能显著改善5xFAD小鼠的学习和记忆缺陷，并挽救海马CA1神经元的突触丢失及突触强度减弱。GV1001 treatment remarkably reduced amyloid plaque burden in the hippocampus and cortex,同时降低了神经炎症标志物IBA1和GFAP的表达，并下调了促炎细胞因子水平。进一步研究发现，GV1001并未改变淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）的淀粉样生成加工途径，而是通过增加围绕大型淀粉样斑块（直径>45 μm）的吞噬性小胶质细胞（CD68+）和总小胶质细胞的数量来促进Aβ清除，该效应并非通过促进小胶质细胞增殖或抑制细胞死亡实现，而是依赖于小胶质细胞向斑块的募集。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析揭示，GV1001显著改变了小胶质细胞的转录特征，增加了稳态小胶质细胞和疾病相关小胶质细胞2型（disease-associated microglia stage II, DAM2）的比例，DAM2亚群与增强的吞噬活性和脂质代谢相关。差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）富集分析显示，迁移和吞噬相关基因模块在DAM2中上调，且细胞迁移相关基因高度富集，提示GV1001通过驱动向DAM2状态转换，促进小胶质细胞迁移和Aβ响应。体外实验证实，GV1001促进原代及成年5xFAD小胶质细胞中丝状肌动蛋白（filamentous actin, F-actin）积累和板状伪足（lamellipodium）形成，增强细胞迁移能力和Aβ吞噬能力。
在分子机制探索中，研究人员通过虚拟靶点筛选（Ligand-based virtual target screening, LBVS）和分子对接模拟（Peptide-protein docking simulation）预测，并结合生物素-链霉亲和素拉下实验（Biotin-streptavidin pulldown assay），证实GV1001的直接结合靶点为缓激肽受体1（bradykinin receptor 1, B1R）。药理学抑制（使用B1R特异性抑制剂R715）和遗传学敲低（shRNA）B1R均能阻断GV1001诱导的小胶质细胞迁移、板状伪足形成及Aβ吞噬。体内实验中，鼻内给予R715不仅阻止了GV1001对5xFAD小鼠记忆功能的恢复，还消除了GV1001减少淀粉样斑块负荷及募集吞噬性小胶质细胞的作用，表明GV1001的疗效依赖于B1R。下游信号机制方面，GV1001快速诱导小胶质细胞中mTOR复合物2（mTOR complex 2, mTORC2）关键位点S2481的磷酸化，以及AKT1 S473的磷酸化，而mTORC1关键位点S2448磷酸化变化滞后。使用mTORC1抑制剂雷帕霉素（rapamycin）或mTORC1/2抑制剂Torin 1处理发现，只有Torin 1能阻断GV1001诱导的板状伪足形成和Aβ吞噬，且Torin 1能阻断GV1001诱导的mTORC2激活，而R715也能阻断GV1001引起的mTORC2激活。这些结果表明，GV1001通过结合B1R激活mTORC2-AKT1信号轴，进而调节肌动细胞骨架重组，促进小胶质细胞迁移和吞噬，最终清除Aβ并挽救神经退行性病变。
讨论部分指出，尽管现有AD药物如胆碱酯酶抑制剂仅提供症状缓解，且部分抗Aβ疗法因安全性或疗效问题受到限制，但GV1001在II期临床试验中展现出改善认知的潜力且安全性良好。本研究揭示了GV1001通过调节小胶质细胞表型而非直接抑制Aβ生成的疾病修饰机制。与以往认为B1R介导促炎反应的观点不同，本研究发现B1R在AD背景下的小胶质细胞中发挥神经保护作用，其激活促进Aβ清除。研究人员指出，先前研究中B1R阻断剂SSR240612的高剂量长期使用可能导致非特异性作用，而本研究选用高选择性B1R拮抗剂R715得出了B1R介导保护作用的新见解。此外，scRNA-seq数据显示GV1001不仅影响小胶质细胞，还诱导星形胶质细胞向非炎症性、代谢重塑的反应性状态转变，促进了小胶质细胞-星形胶质细胞间的有益互作，避免了过度的神经胶质增生。综上所述，本研究确立了GV1001通过B1R-mTORC2轴调节小胶质细胞DAM2表型转换及Aβ清除的新机制，强调了多靶点神经保护和胶质细胞互作重塑在AD治疗中的重要性，为GV1001作为AD疾病修饰疗法的临床应用提供了坚实的分子机制基础。
