解开四硫钼酸盐（TTM）介导的铜离子螯合以及在牛血清白蛋白中形成铜-TTM复合物的机制

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Unravelling mechanism of tetrathiomolybdate (TTM) mediated copper sequestration and copper-TTM complex formation in bovine serum albumin

　　

作者：Manmeet Singh、Biplab K. Maiti

印度查谟大学科学学院化学系，Canal Road，查谟 180001

摘要

在病理条件下，血清白蛋白中铜含量升高时，通常使用强效铜螯合剂四硫钼酸铵（ATTM，[NH₄]₂[MoS₄]）进行治疗。然而，铜的隔离机制以及Cu/TTM复合物的形成机制仍不清楚。本研究以含有ATCUN基序（氨基末端铜镍结合位点）、药物结合位点（位点I–III）和荧光探针（Trp-213/Trp-134）的牛血清白蛋白（BSA）为模型，探讨了Cu与TTM之间的潜在相互作用位点，并研究了BSA、Cu和TTM混合顺序对铜隔离及Cu/TTM复合物形成的影响。紫外/可见光谱显示，随着波长从465纳米变为500纳米，峰强度降低，表明形成了Cu/TTM复合物。当首先加入TTM时，转化过程较快；而当Cu(II)预先与BSA的ATCUN位点结合时，转化速度相对较慢。相比之下，预先形成的Cu/TTM复合物在BSA存在下光谱没有变化。脱盐后，原位形成的Cu/TTM复合物仍与BSA结合，而预先形成的Cu/TTM复合物则不结合，说明其与BSA的结合力较弱。发射光谱淬灭和波长变化揭示了Cu(II)、TTM和Cu/TTM复合物的潜在结合位点。电子顺磁共振（EPR）光谱显示，尽管TTM与Cu(II)–ATCUN–BSA的亲和力很高，但添加TTM后Cu(II)的信号部分减弱；当TTM先于Cu(II)加入时，Cu(II)的信号减弱更为明显。实验表明，TTM能有效从过载的Cu(II)–BSA中提取铜，这一点通过紫外/可见光谱和EPR光谱特征得到证实。

引言

铜的转运对于维持细胞内铜的稳态和促进铜依赖性蛋白质的成熟至关重要[1]、[2]。这一过程的紊乱会导致细胞内铜积累过多，从而引发多种人类疾病，包括威尔逊病（WD）、神经退行性疾病和多种癌症[3]、[4]。在威尔逊病患者中，细胞外的铜与血清白蛋白结合[5]、[6]，血清白蛋白具有很强的铜结合能力[8]、[9]，包含四个不同的金属结合位点：第一个铜原子紧密结合在ATCUN位点（氨基末端铜镍结合基序[10]），第二个铜原子中等程度结合在多金属结合位点（MBS）上，其余铜离子则弱结合在血清白蛋白的其他位点[8]、[11]、[12]。此外，血清白蛋白还具有三个药物结合位点（位点I、II和III），以及两个内在荧光探针Trp134（位于表面暴露的IB结构域（位点III）和Trp213（位于位点I），这些位点极易受到小分子的影响[12]、[13]、[14]、[15]。

在病理条件下，血清白蛋白可以结合过量的铜[16]，从而产生异常的铜-蛋白质相互作用，促进活性氧（ROS）的生成和蛋白质聚集[17]、[18]、[19]。因此，临床上使用铜螯合剂（如四硫钼酸铵（(NH₄)₂TTM）[3]）来管理铜过载引起的毒性，该药物能有效去除血清白蛋白上特异性和非特异性结合位点的过量铜[3]、[9]、[20]。血清白蛋白的ATCUN基序对铜的亲和力较低（K_d = 0.9 × 10^?12 M – 6.7 × 10^?17 M [16]、[21]），而TTM的亲和力较高（K_d = 2.3 × 10^?20 M [22]）。因此，TTM通过形成Cu/TTM复合物有效地从ATCUN位点提取铜，这些复合物随后可能被容纳在特定的药物结合口袋或非特异性位点中[9]。然而，血清白蛋白与Cu和TTM的相互作用、它们的潜在结合位点，以及混合顺序和化学计量比对铜隔离及Cu/TTM复合物形成的影响仍不甚明了。理解这些相互作用对于阐明TTM介导的铜隔离、Cu/TTM复合物形成及其后续排泄机制至关重要。

因此，我们使用BSA作为人类血清白蛋白的模型，研究Cu和TTM之间的潜在相互作用位点，以及它们的添加顺序对铜隔离和Cu/TTM复合物形成的影响。此外，BSA可以结合过量的铜形成Cu(II)-过载的BSA，TTM可以从中有效提取铜。这些过程通过紫外/可见光谱、荧光光谱、电子顺磁共振（EPR）和脱盐色谱法进行了表征。紫外/可见光谱分析显示形成了Cu/TTM复合物，并证明反应速率取决于添加顺序。脱盐实验表明，Cu/TTM复合物在BSA中的结合较为牢固。荧光研究可以确定TTM、Cu和Cu/TTM复合物在BSA基质中的结合位点。最后，EPR分析揭示了TTM介导的铜隔离及Cu/TTM复合物的形成，表现为Cu(II)信号强度的降低。

章节片段

结果与讨论

本研究在50 mM Tris–H?SO?、pH 7.5的氧化条件下，通过紫外/可见光谱、荧光光谱和电子顺磁共振（EPR）光谱研究了BSA、Cu和TTM之间的相互作用。

总体讨论

BSA含有一个ATCUN位点、三个药物结合位点（位点I、II和III）以及两个内在荧光探针（Trp113和Trp213）[8]、[11]、[12]。ATCUN位点特异性结合Cu(II)离子，而药物结合位点可以与小分子或药物相互作用[12]、[13]、[14]、[15]。根据光谱结果，提出了Cu和TTM的结合位点，以及TTM介导的铜隔离和Cu/TTM复合物形成的可能机制

结论

总之，通过紫外/可见光谱、荧光光谱和电子顺磁共振（EPR）光谱研究了BSA与Cu(II)和TTM的相互作用，以及TTM介导的铜隔离和Cu/TTM复合物的形成。当首先加入Cu(II)时，它会与BSA的ATCUN基序结合。随后加入TTM时，由于Mo/Cu的拮抗作用及其对Cu(II)的高亲和力，TTM会迁移到Cu(II)–ATCUN位点，但TTM无法完全从Cu(II)-ATCUN位点提取铜

材料与试剂

四硫钼酸铵（[NH₄]₂[MoS₄）、硫酸铜（CuSO₄）、牛血清白蛋白（BSA）和Tris碱（tris(hydroxymethyl)aminomethane）等化学品均购自Sigma公司，无需进一步纯化即可使用。样品在含有50–100 mM Tris-H₂SO₄、pH 7.5的标准生理缓冲液中制备。所有实验溶液均使用双蒸水配制。反应在室温下进行，重复三次。

储备溶液和Tris缓冲液的制备

储备溶液的制备...

紫外/可见光谱

所有用于监测BSA、TTM和Cu(II)之间相互作用、铜隔离及Cu/TTM复合物形成的紫外/可见光谱测量均在Shimadzu 1900i紫外-可见光谱仪上进行，波长范围为200–900纳米。所有溶液均在指定的反应条件下制备。

荧光光谱

荧光光谱使用RF-6000荧光光谱仪（Shimadzu）在室温下进行测量，使用1.0厘米石英细胞。所有溶液均在指定的反应条件下制备

CRediT作者贡献声明

Manmeet Singh： 数据分析、数据整理。Biplab K. Maiti： 文章撰写、审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

MS和BKM感谢DST–SERB提供的CRG资助（文件编号：CRG/2022/005673）以及查谟大学提供的基础设施支持。