《Nature Neuroscience》：Single-cell multi-omic atlas and morphogen screening informs midbrain and hindbrain organoid engineering
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神经管的模式化过程确立了中脑和后脑结构，这些结构协调运动功能、处理感觉输入并整合认知功能。这些结构内的细胞损伤是多种神经系统疾病的基础，而体外类器官模型为理解发育过程和建模疾病提供了有望取得突破的途径。在此研究中，研究人员利用配对单细胞转录组和染色质可及性测序
神经管的模式化过程确立了中脑和后脑结构，这些结构协调运动功能、处理感觉输入并整合认知功能。这些结构内的细胞损伤是多种神经系统疾病的基础，而体外类器官模型为理解发育过程和建模疾病提供了有望取得突破的途径。在此研究中，研究人员利用配对单细胞转录组和染色质可及性测序，绘制了中脑和后脑类器官模型中的细胞组成和调控机制图谱。研究人员发现，现有的中脑类器官方案生成了腹侧和背侧细胞类型，覆盖了包括底板、中脑背侧和腹侧以及相邻后脑区域在内的区域。通过基因调控网络推断和转录因子扰动，解析了神经元分化背后的机制。单细胞多重模式化筛选确定了能够扩展现有类器官模型的形态发生素浓度，包括产生延髓甘氨酸能神经元和小脑谷氨酸能亚型的条件。综合而言，多组学图谱和形态发生素筛选揭示了指导区域特异性祖细胞分化为后脑多种神经元类型的形态发生素-调控子关系。
中脑和后脑在协调运动和处理感觉输入方面发挥关键作用，其功能障碍与多种神经系统疾病（如脑畸形和帕金森病）密切相关。在发育过程中，中脑和后脑由神经管前部衍生而来，分别发育为人类大脑的特定结构区域，其中中脑-后脑边界作为关键的组织结构中心，通过FGF8和WNT信号建立峡部组织者，从而通过相互作用的信号梯度模式化这两个区域。转录边界OTX2（中脑）和GBX2（后脑）的表达域通过交叉抑制得以维持，定义了后脑的基本前后轴。中脑的特化依赖于峡部的FGF8–WNT1信号枢纽，该枢纽诱导一系列转录调控事件，协调祖细胞的增殖、身份确立和分化，包括EN1/2、NGN2和MASH1（ASCL1）等因子。重要的是，该调控网络通过下游激活LMX1a、MSX1和NURR1来指导中脑多巴胺能神经元（DA neurons）的特化。相比之下，后脑发育涉及 rombomere 分割，每个区域由独特的HOX基因表达模式与MEIS和PBX共因子协同作用指定。视黄酸（RA）梯度提供关键的前后轴模式化线索以形成 rombomeric 边界。利用这些发育原理为在体外生成后脑细胞和组织提供了机会。然而，现有的类器官协议在覆盖后脑区域神经元群体方面存在不足，且如何生成特定的后脑区域并有效控制同一神经组织内多个感兴趣区域的共发育尚不明确。因此，研究人员旨在通过单细胞多组学分析和形态发生素筛选，系统解析后脑类器官的发育动态并优化其生成方案，这一研究发表在《Nature Neuroscience》。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，利用人诱导多能干细胞（iPSCs）建立中脑/后脑类器官模型，并通过时间序列单核多组学（scMultiome）技术，同步获取转录组和染色质可及性数据以构建细胞图谱；其次，采用基因调控网络（GRN）推断算法结合单细胞CRISPR-Cas9多重基因敲除（KO）筛选实验，解析转录因子对细胞命运决定的调控机制；最后，设计基于单细胞RNA测序读出的组合形态发生素模式化筛选，测试48种形态发生素浓度和组合条件，并运用空间转录组学（MERFISH/MERSCOPE）技术验证类器官的组织结构。样本来源为三种不同的人类iPSC细胞系（HOIK1, WIBJ2, WTC）。
研究结果显示，研究人员首先构建了人后脑类器官发育的单核多组学图谱。对比发育中人类大脑细胞图谱发现，两种现有的中脑类器官方案均生成了显著比例的后脑细胞类型（约57%），包括甘氨酸能神经元和浦肯野细胞，表明成功实现了后脑化而不仅限于中脑细胞。Protocol 1主要产生多巴胺能神经元，而Protocol 2主要产生谷氨酸能神经元和GABA能神经元。染色质可及性动力学分析表明，全基因组染色质可及性动态在 distinct 神经元细胞类型的特化中起关键作用，且类器官细胞的染色质特征与初级大脑发育中的对应细胞高度相似。在基因调控网络方面，研究人员通过CRISPR筛选验证了OTX2、EBF3、MYT1L等转录因子对细胞命运的关键调控作用。例如，OTX2敲除导致细胞组成向其后脑身份偏移，而EBF3敲除阻碍了从神经祖细胞向神经元的转变。此外，组合形态发生素筛选成功扩展了类器官模型，识别出产生延髓甘氨酸能神经元和小脑谷氨酸能神经元的新条件，显著增加了后脑细胞类型的多样性。差异丰度 informing 的轨迹推断揭示了形态发生素与特定调控子之间的调控关系，例如视黄酸（RA）与PAX6/PAX7在延髓特化中的作用，证明了体外形态发生素扰动能够解析复杂的分化轨迹。
讨论部分总结指出，该研究提供了详尽的人后脑类器官发育单核多组学图谱，证实现有协议能生成混合的中脑和后脑细胞群。研究通过遗传扰动数据集揭示了脑区特异性程序，多数程序在神经祖细胞和神经元层面共享，表明相似的遗传程序负责区域身份的 Establishments 和维持。系统性的形态发生素信号调节扩展了体外生成的后脑细胞类型多样性，生成的新细胞类型可作为研究过度惊醒症样障碍（hyperekplexia-like disorders）和自闭症谱系障碍（ASD）的模型，并有助于儿科脑肿瘤靶向疗法的评估。RA效应通常占主导地位，_override_其他FGF效应，提示使用较轻度的尾化剂可实现更精细的脑干模式化。最后，将差异细胞丰度整合入轨迹推断，弥补了纯转录组相似性方法在区分高相似性祖细胞（如背侧和腹侧延髓）时的不足，展示了器官芯片形态发生素筛选数据在重建初级大脑图谱分化轨迹中的独特价值。研究结论强调，这些形态发生素筛选结合单细胞基因组读数，为优化区域特异性协议和高分辨率探索神经元分化轨迹提供了重要资源。
