利用LAG3导向的白细胞介素-2靶向肿瘤特异性T细胞以阻断T细胞耗竭并重振抗肿瘤免疫

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Targeting tumor-specific T cells with LAG3-directed interleukin-2 prevents T-cell exhaustion and reinvigorates antitumor immunity

　　

LAG3（淋巴细胞活化基因3，Lymphocyte Activation Gene-3）是一种在肿瘤微环境（TME）内耗竭T细胞上高度富集的关键抑制性受体，其作为T细胞耗竭的关键驱动因素，而T细胞耗竭是强效抗肿瘤免疫的典型屏障。在结肠癌模型中，LAG3⁺CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）构成了肿瘤特异性T细胞的主要类型，但表现出缺陷的白细胞介素-2（IL2）信号传导。为探讨外源性IL2补充是否能解除其功能障碍，研究人员构建了LAG3-LaIL2（低亲和力IL2，low-affinity IL2），这是一种融合蛋白，可选择性地将IL2递送至LAG3⁺CD8⁺ TILs。LAG3-LaIL2扩增了耗竭前（pre-exhausted）肿瘤特异性CD8⁺ T细胞，将其耗竭轨迹重编程为中间效应状态，并阻止了终末耗竭（terminal exhaustion），从而导致小鼠肿瘤消退和生存期延长。机制上，LAG3-LaIL2通过上调高亲和力IL2受体亚基CD122（即IL2Rβ），恢复了IL2R-JAK3-STAT5信号传导，从而恢复了TIL功能。此外，LAG3-LaIL2在引流淋巴结（draining lymph nodes，dLNs）中扩增了肿瘤特异性效应T细胞和记忆T细胞，实现了针对远端肿瘤的系统性抗肿瘤免疫并防止肿瘤复发。综上所述，研究结果表明LAG3-LaIL2是一种精准免疫疗法，特异性靶向耗竭TILs，同时限制IL2对非靶细胞的暴露，从而增强了该方法的疗效和安全性。这一策略为克服实体瘤中的T细胞耗竭提供了可转化的方案，代表了改善癌症患者临床预后的有前景的途径。

免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）疗法靶向PD-1/PD-L1通路已在临床上取得显著成功，但肿瘤常通过代偿性上调其他抑制性受体（包括LAG3和TIM3）来逃避免疫清除，这些受体驱动T细胞功能障碍和耗竭。LAG3（CD223）作为一种在耗竭和功能障碍的肿瘤浸润CD8⁺ T细胞上富集的共抑制受体，与PD-1协同抑制T细胞受体（T cell receptor，TCR）信号传导和细胞因子产生，从而在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中建立稳固的免疫抑制轴。尽管双抗PD-1/LAG3阻断疗法（如Opdualag^?）已于2022年获FDA批准用于不可切除或转移性黑色素瘤，但许多患者仍因耗竭T细胞的表观遗传和功能异质性而无法产生应答。耗竭CD8⁺ T细胞具有显著异质性，包括具有可塑性表观遗传谱的早期功能障碍亚群和具有稳定固定表观遗传状态的功能不可逆的终末耗竭群体。其中，关键的"耗竭前"（pre-exhausted）LAG3⁺CD8⁺ T细胞亚群保留部分功能和重编程潜力，为恢复抗肿瘤免疫提供了治疗窗口。白细胞介素-2（interleukin-2，IL2）作为一种强效T细胞生长因子，理论上可通过激活IL2R-JAK3-STAT5轴来恢复这些细胞的功能，但该通路在耗竭T细胞中常受损。然而，IL2的治疗应用受到其体内半衰期短、促进调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）分化和稳态（这直接对抗效应T细胞的细胞毒性抗肿瘤潜力）以及治疗剂量下致死性毒性风险等限制。因此，急需开发能够选择性将IL2递送至肿瘤组织内效应细胞同时最小化全身毒性的策略。

为应对这些挑战，研究人员设计了LAG3-LaIL2融合蛋白，该蛋白将抗LAG3抗体与低亲和力IL2变体（low-affinity IL2 variant，LaIL2）偶联，旨在通过顺式靶向（cis-targeted） delivery 同时阻断LAG3抑制通路并激活IL2信号，从而选择性激活TME内的LAG3⁺CD8⁺ T细胞。该研究确立了LAG3-LaIL2作为一种精准免疫疗法，将IL2的抗肿瘤效力与LAG3靶向的空间特异性相结合，解决了当前ICB和细胞因子疗法的关键局限性。

研究采用MC38结肠癌、B16-F10黑色素瘤和CT26结肠癌小鼠模型，以及基于NSG-SGM3小鼠重建人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的CFPAC1胰腺癌人源化模型。主要技术方法包括：单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）用于T细胞亚群转录组分析；多参数流式细胞术检测细胞表面标志物、细胞内细胞因子（如IFN-γ、颗粒酶A即GZMA）和信号分子磷酸化（p-STAT5、p-JAK3）；酶联免疫斑点实验（ELISPOT）和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估T细胞功能和细胞毒性；通过抗体耗竭（anti-CD8、anti-NK1.1、anti-CD4）和FTY720（淋巴细胞迁出抑制剂）验证细胞依赖性；建立Rag1^-/-小鼠双肿瘤模型评估系统性抗肿瘤免疫和远端效应。

研究首先发现，在MC38肿瘤模型中，肿瘤特异性CD8⁺ T细胞主要定位于TME，且大多数共表达LAG3。随着肿瘤进展，LAG3⁺CD8⁺ T细胞亚群扩增，且晚期肿瘤中效应和耗竭CD8⁺ T细胞的IL2信号相关基因（Il2ra、Il2rb和Stat5a）表达显著降低，表明LAG3⁺CD8⁺ T细胞功能障碍伴随IL2应答受损。

研究人员构建了两种格式的LAG3-LaIL2融合蛋白：同源二聚体LAG3-InFc-LaIL2和异源二聚体LAG3×LaIL2，使用识别人和小鼠LAG3的单链可变片段（single-chain variable fragment，scFv）。结合实验显示，LAG3-LaIL2对外周Tregs和CD8⁺ T细胞结合极少，但对肿瘤内LAG3⁺CD8⁺ T细胞表现出优先结合，而对LAG3^-CD8⁺ T细胞结合可忽略不计，表明其有效且选择性地靶向肿瘤内LAG3⁺CD8⁺ T细胞。

通过scRNA-seq分析，研究人员鉴定出16个转录组不同的T细胞亚群，包括耗竭前（Tex-pre）、中间耗竭效应（Tex-int）和终末耗竭（Tex-term）CD8⁺ T细胞。LAG3-InFc-LaIL2单药治疗导致Tex-pre和Tex-int群体显著扩增，同时减少Tex-term频率，并提高CD8⁺/Treg比值，表明其选择性维持耗竭前和中间耗竭CD8⁺ T细胞而减少终末耗竭群体，从而重塑TME。

机制研究表明，LAG3-InFc-LaIL2增强了Tex-int亚群的TCR信号通路和IFN-γ反应，显著增加肿瘤特异性CD8⁺ T细胞比例和GZMA⁺CD8⁺ T细胞数量，增强对靶细胞的细胞毒性。该融合蛋白通过上调高亲和力IL2受体亚基CD122（IL2Rβ），恢复了IL2R-JAK3-STAT5信号传导，促进STAT5和JAK3磷酸化，并减少终末耗竭标志物TOX的高表达，从而阻止向终末耗竭分化，维持效应样表型。

在疗效评估中，LAG3-InFc-LaIL2在MC38、B16-F10和CT26模型中均显示出比LAG3×LaIL2和抗LAG3联合InFc-LaIL2更强的肿瘤控制能力，且无明显体重下降或全身毒性。在人源化CFPAC1模型中，LAG3-InFc-LaIL2治疗导致完全肿瘤根除。与使用野生型IL2（WTIL2）的融合蛋白相比，LaIL2版本显著降低血清炎症细胞因子IFN-γ水平，安全性更好。

通过细胞耗竭实验，研究人员发现CD8⁺ T细胞耗竭完全消除LAG3-InFc-LaIL2的抗肿瘤疗效，而NK细胞和CD4⁺ T细胞耗竭无显著影响。FTY720处理仅轻微降低疗效，表明其主要依赖肿瘤驻留CD8⁺ T细胞而非新招募的淋巴结来源T细胞。Rag1^-/-小鼠接受野生型CD8⁺ T细胞过继转移后治疗有效，而接受Lag3^-/- CD8⁺ T细胞转移则疗效显著降低，证明LAG3在CD8⁺ T细胞上的表达是疗效所必需的。在双肿瘤模型中，局部给予LAG3-InFc-LaIL2不仅抑制原发肿瘤生长，还显著抑制远端未治疗肿瘤进展，外周血中可检测到迁移的肿瘤特异性CD8⁺ T细胞，表明其诱导系统性抗肿瘤免疫。

进一步研究显示，LAG3-InFc-LaIL2治疗后，引流淋巴结中肿瘤特异性CD8⁺ T细胞显著积累，表现为CD44⁺CD62L^-效应表型和GZMA⁺表达，且上调IL2Rβ表达。将这些引流淋巴结细胞过继转移至Rag1^-/-小鼠可有效预防肿瘤复发。治愈小鼠在再次接种MC38细胞后自发排斥肿瘤，表明建立了持久免疫记忆。

综上所述，研究人员开发了新型LAG3靶向融合蛋白LAG3-InFc-LaIL2，选择性递送IL2至肿瘤浸润CD8⁺ T细胞。该策略通过阻断LAG3抑制信号并激活IL2-STAT5通路，扩增耗竭前和中间耗竭T细胞，阻止终末耗竭，恢复细胞毒性功能，同时避免全身毒性。与现有ICB和细胞因子疗法相比，该方法具有肿瘤微环境特异性、独立于PD-L1表达、且能诱导系统性免疫记忆和防止复发的优势，代表了一种有前景的精准免疫治疗策略，为克服实体瘤T细胞耗竭提供了可临床转化的方案。