孟鲁司特(Montelukast, MTK)通过破坏神经元视黄酸(Retinoic Acid, RA)信号通路诱导孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)样行为

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Anti-asthma drug montelukast induces autistic behaviors via disrupting neuronal retinoic acid signaling

　　

摘要：孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)影响全球约1.0%的儿童，且其患病率持续上升。遗传因素仅占ASD病因的不到50%，提示非遗传因素在ASD发病中具有关键且尚未明确的作用。本研究报道，孟鲁司特(Montelukast, MTK)——一种半胱氨酰白三烯受体(Cysteinyl Leukotriene Receptor, CysLTR)拮抗剂及最常用的处方抗哮喘药物之一——可显著破坏大鼠前额叶皮质(Prefrontal Cortex, PFC)原代神经元的视黄酸(Retinoic Acid, RA)信号通路并改变突触可塑性。产前或出生后早期暴露于MTK可诱导野生型大鼠出现孤独症样行为，该行为可通过补充全反式视黄酸(All-trans Retinoic Acid, atRA)显著缓解。MTK通过在RA信号传导中拮抗RA，扰乱人胚胎干细胞来源的大脑类器官的RA信号及前脑模式化。同时，分子对接结合生化验证强烈表明MTK可与RA受体(Retinoic Acid Receptor, RAR)，如RA受体α(Retinoic Acid Receptor α, RARA)发生物理相互作用。此外，针对大型中国ASD队列的多中心调查显示，婴幼儿期使用MTK可能确实增加儿童患ASD的风险。综上，本研究不仅确立MTK使用为一个人ASD的未被识别的危险因素，还强调了安全用药以预防ASD的重要性。

研究背景与意义

孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)是一种复杂的神经发育疾病，以社交缺陷和重复刻板行为为核心特征。尽管全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study, GWAS)发现了众多候选基因变异，但遗传因素仅能解释不足50%的病例，环境因素的作用日益受到关注。视黄酸(Retinoic Acid, RA)是维生素A的活性代谢物，对大脑发育、轴突导向及突触可塑性至关重要，其信号异常已被暗示与部分ASD亚型相关。孟鲁司特(Montelukast, MTK)是临床广泛使用的白三烯受体拮抗剂，虽既往有散在报道提示其可能引起神经精神不良事件，但其对发育中大脑的影响及机制不明。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，旨在探究MTK是否通过干扰RA信号通路影响神经发育并增加ASD风险。

主要关键技术方法

研究人员开展以下核心实验：(1) 基于RA反应元件(RA-Responsive Element, RARE)驱动荧光素酶报告基因的高通量药物筛选；(2) 多中心病例对照研究（中国Multi-center Preschool Autism Program, CMPAP队列，1232例ASD患儿及1239例正常对照儿童）分析早期MTK暴露与ASD风险的关联；(3) 大鼠产前(E7.5-E21.5)及出生后早期(PND14-PND28)MTK暴露模型，进行三箱社交及自我梳理行为学测试，并补充全反式视黄酸(All-trans Retinoic Acid, atRA)验证可逆转性；(4) 人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cell, hESC, H9系)诱导分化的大脑类器官MTK处理，结合Bulk RNA-seq、核糖体印记测序(Ribosome Profiling)、单细胞RNA测序(Single Cell RNA-seq, scRNA-seq)及免疫荧光分析背腹侧模式化与兴奋/抑制(Excitatory/Inhibitory, E/I)神经元比例；(5) 分子对接(Molecular Docking)、微量热涌动(Microscale Thermophoresis, MST)、RA-固定化珠子竞争性洗脱及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)验证MTK与RA受体α(Retinoic Acid Receptor α, RARA)的直接结合及对RAR-RXR异二聚化的干扰。

研究结果

Montelukast is a negative regulator of the cellular retinoic acid signaling pathway

研究人员利用RARE-荧光素酶报告系统筛选54种FDA批准药物，发现MTK浓度依赖性抑制RA诱导的报告基因表达，且不影响细胞活力。在原代大鼠前额叶皮质(Prefrontal Cortex, PFC)神经元中，MTK同样抑制RA或D-APV/TTX（促进内源性RA合成）激活的RARE-hrGFP报告信号，证实MTK是细胞RA信号通路的负调控因子。

Children with montelukast administration show an increased risk of childhood autism

对中国CMPAP队列的Logistic回归分析显示，出生3年内曾使用MTK的儿童患ASD的调整后比值比(Adjusted Odds Ratio, aOR)为1.377 (95% CI: 1.032–1.838)，提示早期MTK暴露可能增加ASD患病风险。

Montelukast administration leads to autistic-like behaviors in rat models by disrupting RA signaling

大鼠产后(PND14-28, 4 mg/kg)或孕期(E7.5-E21.5, 1/10 mg/kg)经口给予MTK，子代在5-6周龄表现出三箱实验中社交偏好及社交新颖性识别受损、自我梳理时间延长等孤独症样行为。补充atRA可部分挽救社交缺陷。MTK暴露不改变血清RA水平，但降低前额叶皮质RARA/B蛋白表达，表明MTK通过破坏脑内RA信号而非影响RA生物合成诱发行为表型。

Montelukast disrupts RA signaling and alters the expression of ASD risk genes in human brain organoids

人脑类器官从D20起持续暴露于MTK至D60，体积减小。转录组分析显示46个RA信号相关基因(RA Signaling-related Genes, RASGs)差异表达，与RA合成抑制剂DEAB处理有显著重叠；同时44个SFARI收录的ASD风险基因差异表达，其中接触蛋白相关蛋白2(CNTNAP2)为蛋白互作网络核心节点，提示MTK扰乱RA信号并改变ASD风险基因表达。

Montelukast alters the dorsal-ventral patterning and the ratio of excitatory/inhibitory (E/I) neurons in human cerebral organoids

MTK处理的类器官背侧前脑标记(RELN, TBR1, PAX6等)下调，腹侧前脑标记(OLIG2, NKX2-1, DLX2等)上调。scRNA-seq显示兴奋性神经元(Excitatory Neuron, EN)比例下降，抑制性中间神经元(Inhibitory Interneuron, IN)比例上升，E/I比值显著降低；免疫荧光验证PAX6⁺放射状胶质细胞减少、NKX2-1⁺中间神经元前体增多。大鼠PFC也出现vGLUT1⁺谷氨酸能神经元减少、GAD1⁺GABA能神经元增多及微小兴奋性/抑制性突触后电流(mEPSC/mIPSC)振幅E/I比下降，atRA补充可改善此失衡。

Montelukast inhibits RA signaling through competitive binding to RARα and disrupting RAR-RXR heterodimerization

分子对接预测MTK占据RARA配体结合口袋，与RA竞争相同位点。MST测得MTK与重组RARA蛋白结合的Kd为7.13 ± 2.99 μM。RA-固定化珠子实验显示MTK可剂量依赖性洗脱结合的RARA-HA。Co-IP显示MTK处理减少RXRβ(Retinoid X Receptor β, RXRB)共沉淀的RARA，双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)证实MTK削弱RARA-RXRB异二聚化。点突变实验确定C235、R276、S287、F302为MTK结合关键残基，其联合突变可阻断MTK对异二聚化的破坏作用。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，本研究首次通过RA信号抑制筛选鉴定出常用抗哮喘药MTK为RA信号拮抗剂，MTK直接结合RARA并阻碍RAR-RXR异二聚体形成，从而抑制RA依赖性转录。该作用导致人脑类器官背腹侧模式化异常及E/I神经元比例失衡，在大鼠诱导孤独症样行为，并与中国儿童队列中早期MTK暴露后ASD风险升高(aOR=1.377)相关联。研究揭示MTK是ASD潜在的环境危险因素，强调对中枢作用不明显的常用药物需重新评估其神经发育安全性，并验证了脑类器官在药物神经精神毒性筛查中的价值。结论：孟鲁司特(Montelukast, MTK)通过竞争性结合视黄酸受体α(Retinoic Acid Receptor α, RARA)、破坏RAR-RXR异二聚化进而抑制神经元视黄酸(Retinoic Acid, RA)信号通路，引起大脑前脑模式化异常及兴奋/抑制(Excitatory/Inhibitory, E/I)神经元平衡失调，在动物模型诱导孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)样行为，且婴幼儿期MTK暴露与中国人群ASD风险升高相关，MTK是ASD此前未被识别的环境危险因素。