中国东北地区六种蜱媒致病病毒单重TaqMan实时荧光定量PCR（TaqMan real-time quantitative PCR, RT-qPCR）检测方法的建立与评价

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Development and evaluation of single-plex TaqMan real-time quantitative PCR assays for the detection of six tick-borne pathogenic viruses in northeastern China

背景：中国东北地区是蜱媒病毒性疾病公认的热点区域，但目前尚缺乏能同时检测新兴及再现性蜱媒病毒的可靠方法。方法：研究人员利用Beacon Designer 8.0软件设计引物与探针，靶向阿龙山病毒（Alongshan virus, ALSV）、蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）、发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV）、北极内罗病毒（Beiji nairovirus, BJNV）、虾夷病毒（Yezo virus, YEZV）及松花岭病毒（Songling virus, SGLV）基因组的保守区。构建重组质粒评估检测灵敏度，利用蜱源病毒阳性cDNA验证特异性，并使用野外采集蜱类样本进行方法学验证，以已发表参比方法作为金标准进行比较。结果：设计并获得特异性引物探针组合，扩增片段长度83～199 bp；经反应体系优化，终浓度引物0.2～0.5 μL（10 μM工作液）、探针0.4～1.0 μL（10 μM工作液）。灵敏度分析显示6种病毒检出限（limit of detection, LOD）均低至10 copies/μL；特异性试验证实靶标间无交叉反应。验证试验中，所建TaqMan RT?qPCR与参比方法对ALSV（5/15）和TBEV（4/14）结果完全一致；对SFTSV（n=1）、BJNV（n=3）及YEZV（n=1）检出了参比方法因病毒载量低而漏检的额外阳性样本；但2份经SYBR Green RT?qPCR判定为SGLV阳性的样本在本研究中呈阴性。结论：研究人员成功建立了针对中国东北地区6种重要蜱媒病毒的高灵敏度、高特异性单重TaqMan RT?qPCR检测方法，可用于蜱群病毒学监测，并具有潜在的临床应用诊断价值。

论文解读：中国东北地区六种蜱媒致病病毒单重TaqMan RT?qPCR检测方法的建立与评价

本研究发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。蜱媒疾病是全球公共卫生日益增长的威胁，尤其在中国东北地区已被确认为蜱媒病毒性疾病热点区域，目前已发现黄病毒科（Flaviviridae）、内罗病毒科（Nairoviridae）及布尼亚病毒科（Phenuiviridae）中多种可感染人的蜱媒病毒。然而，现有诊断手段缺乏能标准化、灵敏地同时或分别检测这些新兴及再现性蜱媒病毒的方法，且部分已报道方法未充分考虑中国东北地区流行毒株的基因多样性，易造成漏检。为此，研究人员针对在中国东北已确认可致人类感染的六种代表性蜱媒病毒——阿龙山病毒（ALSV，四节段单股正链RNA黄病毒）、蜱传脑炎病毒（TBEV，单股正链RNA黄病毒）、发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV，三节段负链RNA表病毒/Phlebovirus，即Phenuiviridae），以及内罗病毒科的北极内罗病毒（BJNV，二节段负链RNA）、虾夷病毒（YEZV，三节段负链RNA）与松花岭病毒（SGLV，三节段负链RNA）——开展了单重TaqMan实时荧光定量逆转录PCR（single?plex TaqMan real?time quantitative reverse transcription PCR, TaqMan RT?qPCR）检测体系的建立、优化与现场验证，以期弥补现有方法之不足，为蜱媒病毒流行病学监测及临床鉴别诊断提供可靠工具。

主要关键技术方法：

研究人员从2016—2023年前期研究与2020—2023年中国东北野外采集游离蜱（flagging法），经形态学与分子鉴定后按种类与地点10只/池匀浆、离心取上清提取病毒RNA并逆转录为cDNA保存备用。自NCBI GenBank下载上述6种病毒中国东北及俄远东流行株全基因组序列，用Beacon Designer 8.0软件分析保守区并设计特异性引物与TaqMan水解探针（5'标记FAM，3'标记BHQ1）。将目的片段经半巢式PCR扩增、克隆至pMD18?T载体转化Escherichia coli DH5α，挑取阳性克隆经菌落PCR及Sanger测序验证后提取质粒，按公式换算拷贝数并10倍系列稀释制备标准品（10⁸~10¹copies/μL）。通过梯度测试引物/探针终浓度及退火温度确定最优反应体系（20 μL体系含Premix Ex Taq、引物0.2–0.5 μL、探针0.4–1.0 μL、模板cDNA 1 μL），循环条件为95 ℃ 30 s预变性，随后50个循环95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。以系列稀释重组质粒评估灵敏度（LOD），以6种病毒各自阳性蜱cDNA交叉测试评价特异性，并以宏转录组测序确认的蜱池为现场样本，采用既往发表的半巢式PCR（ALSV、TBEV、SFTSV、BJNV）、参照TaqMan RT?qPCR（YEZV）及SYBR Green RT?qPCR（SGLV）作为金标准进行对比验证。

3 Results（结果）

3.1 Primer design and concentration optimization（引物设计与浓度优化）：

研究人员针对6种病毒保守区设计特异引物与TaqMan探针，扩增片段长度分别为ALSV 180 bp（靶基因VP1b）、TBEV 160 bp（E基因）、SFTSV 199 bp（RdRp基因）、BJNV 83 bp（NP基因）、YEZV 134 bp（NP基因）、SGLV 172 bp（RdRp基因）。经矩阵滴定确定各病毒最适引物体积0.2–0.5 μL、探针体积0.4–1.0 μL（均来自10 μM工作液），最适退火温度为60 ℃。

3.2 Standard curves for six tick?borne pathogenic viruses（六种蜱媒致病病毒标准曲线）：

研究人员将克隆的标准质粒系列稀释后进行RT?qPCR扩增，建立各病毒标准曲线，回归方程及决定系数（R²）分别为：ALSV Y = ?4.12X + 49.49（R²=0.996）、TBEV Y = ?4.00X + 40.46（R²=0.999）、SFTSV Y = ?3.38X + 34.12（R²=0.999）、BJNV Y = ?3.82X + 43.78（R²=0.998）、YEZV Y = ?3.67X + 40.96（R²=0.997）、SGLV Y = ?3.53X + 38.39（R²=0.997），表明扩增效率良好且呈高度线性。

3.3 Sensitivity and specificity of the TaqMan RT?qPCR assays（TaqMan RT?qPCR assay的灵敏度与特异性）：

灵敏度试验显示6种病毒检测限（LOD）均可达10 copies/μL。特异性试验表明各病毒阳性模板仅在其对应引物?探针体系中产生典型扩增曲线，其余5种病毒阳性模板及无模板对照（nuclease?free water）均无扩增信号，证实所建方法无种间交叉反应。

3.4 Validation of the viruses in tick samples（蜱样本中的病毒验证）：

研究人员对采自内蒙古牙克石、黑龙江塔河、吉林汪清及辽宁凤城共745只成蜱（包括全沟硬蜱 Ixodes persulcatus、长角血蜱 Haemaphysalis longicornis 及嗜群血蜱 H. concinna）组成的池进行验证。参比方法检出ALSV阳性池5/17、TBEV 4/14、SFTSV 1/11、BJNV 2/17、YEZV 4/7（参照TaqMan）、SGLV 7/9（SYBR Green）。所建TaqMan RT?qPCR与参比方法对ALSV和TBEV检测结果完全一致；对SFTSV、BJNV和YEZV分别额外检出1、3和1个阳性池（低病毒载量样本，参比法漏检）；但2份SYBR Green RT?qPCR判定SGLV阳性之池在本研究中为阴性。阴性对照（无酶水及无病原实验室饲养蜱cDNA）均无扩增。

讨论与结论总结：

研究人员指出，多数蜱媒病毒感染临床表现无特异性且同科/属间血清学交叉反应常见，核酸检测方法尤为必要。虽多重TaqMan RT?qPCR可提高通量，但引物?探针竞争会降低灵敏度并受仪器通道限制，故本研究选用单重体系以保证灵敏度与特异性。相较于传统半巢式PCR（耗时、需测序验证、灵敏度偏低）及SYBR Green RT?qPCR（无探针、易假阳性），本研究广泛纳入中国东北流行株序列设计引探针，所建方法更适于本地区快速检测。局限在于未涵盖该地区其他蜱媒病毒（如Jingmen tick virus等）且未经人源感染样本验证，目前适用于蜱群流行病学筛查，临床人源样本适用性有待进一步考证。

结论（翻译）：研究人员成功建立了针对中国东北地区六种关键蜱媒致病病毒的高灵敏度、高特异性单重TaqMan RT?qPCR检测方法。该方法有助于蜱种群中病毒的快速检测，并为临床应用提供了具重要潜力的诊断工具，可加强中国蜱媒病毒病的预防与控制工作。