湄公河流域曼氏血吸虫（Schistosoma mekongi）及其中间宿主螺Neotricula aperta的环境DNA多重定量PCR检测方法的开发与野外评估

《Infectious Diseases of Poverty》：Development and field evaluation of a multiplex qPCR assay for environmental DNA detection of Schistosoma mekongi and its intermediate snail host Neotricula aperta in the Mekong River Basin

背景：曼氏血吸虫（Schistosoma mekongi）仍是湄公河下游地区肠道血吸虫病的重要致病因素。亟需灵敏的环境监测工具来支持传播监测，尤其是在传统螺类调查受季节限制的情况下。本研究开发并评估了一种多重定量PCR（qPCR）检测方法，用于在环境DNA（eDNA）样本中同时检测S. mekongi及其中间宿主螺Neotricula aperta。 方法：研究人员比较了针对S. mekongi和N. aperta的单重和多重qPCR检测方法，以确定最佳扩增体系。野外验证于2024年5月（旱季）和2024年8月（雨季）在老挝占巴塞省孔县（Khong District, Champasak Province, Laos）的20个传播位点进行。采用Cohen's kappa系数评估eDNA检测与软体动物学调查之间的方法一致性，并使用Spearman秩相关分析N. aperta密度与水理化变量之间的关联。 结果：优化的针对N. aperta（16S rRNA）和S. mekongi（18S rRNA）的多重qPCR检测方法显示出高灵敏度，其检测限（LoD）分别为5拷贝/微升和6拷贝/微升，定量限（LoQ）分别为40拷贝/微升和46拷贝/微升。在中宇宙实验中，当感染螺密度为1只/升时，两个目标均被检出，N. aperta和S. mekongi的中位Cq值分别为35.23和26.54。旱季调查中，共采集到978只N. aperta，平均密度为每点46.25只；雨季调查因条件限制未能进行。压片显微镜检查未发现血吸虫感染。野外eDNA分析检出了N. aperta但未检出S. mekongi，其中N. aperta eDNA阳性率在旱季为90%，在雨季为40%。与软体动物学调查的一致性为中等（κ = 0.44; p = 0.01），且螺密度与水温、pH值和溶解氧显著相关。 结论：这种多重eDNA检测方法能灵敏地检出野外水样中的N. aperta，可能有助于克服软体动物学调查的季节限制。尽管S. mekongi在实验室条件下能被检出，但在野外样本中未检出，这与未发现有感染螺的情况一致。在假定能可靠地进行S. mekongi eDNA野外检测之前，还需要在活跃传播位点进行进一步验证。

论文解读：《湄公河流域曼氏血吸虫及其中间宿主螺环境DNA多重定量PCR检测方法的开发与野外评估》

研究背景与意义

血吸虫病是全球范围内具有重要公共卫生意义的重大水源性寄生虫病。其中，曼氏血吸虫（Schistosoma mekongi）作为六种感染人类的血吸虫之一，是一种典型的人畜共患寄生虫，主要分布在湄公河沿岸的有限区域，特别是柬埔寨和老挝人民民主共和国。该病不仅威胁人类健康，还通过犬、猪等动物宿主维持复杂的传播循环，给消除工作带来了巨大挑战。

目前，针对S. mekongi的环境风险评估主要依赖传统的中间宿主螺（Neotricula aperta）形态学调查，并结合尾蚴逸出试验来确定感染状况。然而，这种方法存在严重的局限性。首先，由于N. aperta成虫体型极小（壳长约3毫米）且受季节性水位变化影响，传统的现场采样在雨季往往难以实施。其次，自然环境中感染螺的流行率极低（通常低于1%），加上缺乏专业的软体动物学专家，导致传统方法的检测灵敏度严重不足。此外，现有调查往往忽略了犬、猪等动物宿主对环境造成的虫卵污染。因此，开发一种不受季节限制、高灵敏度且标准化的环境监测技术，对于实现世界卫生组织（WHO）提出的“全健康”（One Health）行动计划及血吸虫病消除目标至关重要。

本研究正是基于上述迫切需求，旨在开发一种能够同时检测S. mekongi及其宿主螺N. aperta的环境DNA（eDNA）多重定量PCR（qPCR）检测方法。通过在老挝湄公河流域的实地验证，探讨该技术克服传统调查局限性的潜力，为血吸虫病的监测和消除提供新的分子工具。该研究成果发表在了《Infectious Diseases of Poverty》期刊上。

关键技术方法

为实现上述研究目标，研究人员采用了多项核心技术手段。在引物探针设计方面，团队从GenBank数据库中筛选了S. mekongi和N. aperta的保守靶区域，利用生物信息学软件设计了引物和TaqMan-MGB探针，并通过体外（in silico）比对确保了检测的特异性。在实验验证阶段，除了使用实验感染螺的基因组DNA外，还提取了野外采集的同域分布淡水螺样本进行交叉反应测试。为了模拟自然环境，研究人员构建了受控的中宇宙（mesocosm）实验系统，在不同密度的感染螺处理组中培养24小时后收集水样，验证了eDNA采样的有效性。在野外应用环节，研究在老挝南部占巴塞省的四个湄公河岛屿（Done Som, Done Xangphai, Done Long, Done Kadem）设立了20个采样点，分别在旱季（2024年5月）和雨季（2024年8月）采集了1升地表水样，并同步记录了水温、pH、溶解氧和电导率等水理参数。所有水样均经过0.7微米玻璃纤维滤膜真空抽滤，提取eDNA后进行多重qPCR分析。同时，在每个采样点通过打捞石块的方式进行了传统的软体动物学调查，以压片镜检法（crushing microscopy）检查螺类的血吸虫感染情况。最后，利用Cohen's kappa系数评估了eDNA方法与传统调查结果的一致性，并采用Spearman秩相关分析了螺密度与环境因子之间的关系。

研究结果

引物和探针的特异性

经过系统的筛选与验证，研究人员确定了针对S. mekongi 18S rRNA基因和N. aperta 16S rRNA基因的最佳引物探针组合。体外序列比对显示，这些引物探针与目标物种具有100%的同源性，与非目标物种至少有3个核苷酸错配。实验验证表明，该方法对感染螺基因组DNA的平均Cq值分别为N. aperta 12.46和S. mekongi 21.50。重要的是，该方法未与其他感染人类的血吸虫物种（如埃及血吸虫S. haematobium、日本血吸虫S. japonicum和曼氏血吸虫S. mansoni）或其他同域分布的湄公河水生螺类发生有意义的非特异性交叉反应，证明了其高度的特异性。

引物和探针的灵敏度

标准曲线分析显示，N. aperta和S. mekongi的扩增效率分别达到了101.03%和97.23%，在6个数量级的动态范围内表现出极强的线性相关性（r > 0.99）。通过计算，确定N. aperta的检测限（LoD）为5拷贝/微升，定量限（LoQ）为40拷贝/微升；S. mekongi的LoD为6拷贝/微升，LoQ为46拷贝/微升。在中宇宙模拟实验中，即使在每升水中仅存在1只感染螺的极低密度下，0.7微米的玻璃纤维滤膜仍能成功捕获遗传物质，并通过多重qPCR产生稳定的双重阳性信号，证实了该方法在实际水体中的检测能力。

形态学调查结果

在两阶段的野外调查中，旱季（5月）的调查顺利完成，研究人员在20个位点中的18个（90%）发现了N. aperta，共采集到978只个体，平均密度为每点46.25只。然而，通过压片显微镜对所有采集到的螺类进行检查后，未发现任何感染血吸虫的阳性个体。到了雨季（8月），由于极端季风天气导致水位急剧上涨和水流速度过快，传统的软体动物学调查因安全和操作可行性问题而未能进行。

eDNA时空动态

得益于eDNA采样流程的便捷性，研究人员在旱季和雨季均成功采集了60份水样。旱季结果显示，N. aperta eDNA的检出率高达90%（18/20），与软体动物学调查的结果具有中等程度的一致性（Cohen's kappa系数 κ = 0.44, P < 0.05）。然而，雨季的N. aperta eDNA检出率骤降至40%（8/20），且平均Cq值显著升高（37.8 ± 1.2），反映出检测信号强度的减弱。在整个研究期间，所有120份水样中均未检测到S. mekongi的eDNA，这与传统调查中未发现感染螺的结果完全一致。

季节水物理变化

对比旱季和雨季的水理参数发现，两者在所有测量指标上均存在显著差异。旱季的水体特征表现为较高的pH值（8.60）、较高的水温（32.15°C）、较高的溶解氧（9.30 mg/L）以及较高的电导率（374.00 μS/cm）。与之相对，雨季则呈现出较低的温度、酸度、溶氧和电导率。野外观察也证实，旱季水流缓慢清澈，而雨季水流湍急浑浊。这些截然不同的水文条件是影响中间宿主螺栖息地适宜性及eDNA检测效果的关键环境因素。

N. aperta分布的环境决定因素

Spearman秩相关分析揭示了旱季N. aperta密度与水理参数的显著关联：较高的水温（ρ = 0.45, P < 0.01）、较高的pH值（ρ = 0.38, P < 0.01）和较高的溶解氧（ρ = 0.20, P < 0.05）更有利于该螺类的定殖。此外，研究还发现eDNA的信号强度（Cq值）与螺密度呈显著的负相关（ρ = -0.37, P < 0.01），即螺类数量越多，eDNA浓度越高，检测信号越强。相比之下，雨季较高的Cq值反映了eDNA可检测性的降低，这与雨季的高稀释效应和快速水流导致的DNA降解密切相关。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出，本研究开发的灵敏多重qPCR检测方法能够在实验室条件下从200毫升水样中检出感染螺的eDNA，填补了S. mekongi传播环境监测的技术空白。虽然野外调查未能发现S. mekongi eDNA，但这与传统调查未发现感染螺的结果相符，并不意味着方法无效，而是提示未来的验证需要在确认的活跃传播点进行。研究还探讨了eDNA技术的优势，如克服了雨季无法开展传统螺类调查的瓶颈，但也指出了其局限性，例如无法区分检测到的信号是来自游离的eDNA还是完整的尾蚴，以及湄公河高浊度和复杂水文条件对DNA降解和检测灵敏度的影响。

最终，论文得出结论：本研究成功开发了一种新型的多重qPCR检测方法，用于同时检测S. mekongi及其宿主螺N. aperta。在老挝进行的野外评估证实了该方法在检测N. aperta eDNA方面的实用性，而S. mekongi eDNA在野外样本中的缺席则与未检出感染螺的事实一致。因此，在确认该方法能可靠地进行S. mekongi野外检测之前，仍需在活跃传播环境中进行进一步验证。作为一种利用野外样本的基础实验室分子工具，该方法为传统调查提供了一种灵敏的替代方案，若能配备必要的实验室基础设施和后勤支持，将其整合到“全健康”监测体系中，将有助于支持WHO的消除血吸虫病目标。