《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》：Transferrin receptor 1 shedding by the pro-inflammatory iRhom–ADAM17 complex and ADAM10 regulates cellular iron uptake and ferroptosis
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铁稳态是一种受到严格调控的机制，其中铁的摄取、转运、储存和输出均被严密控制。调控失衡及铁摄取过多可导致铁依赖性程序性细胞死亡——即铁死亡（Ferroptosis），其已成为颇具前景的未来癌症治疗靶点。细胞铁摄取受膜结合型转铁蛋白受体1（Transferrin
铁稳态是一种受到严格调控的机制，其中铁的摄取、转运、储存和输出均被严密控制。调控失衡及铁摄取过多可导致铁依赖性程序性细胞死亡——即铁死亡（Ferroptosis），其已成为颇具前景的未来癌症治疗靶点。细胞铁摄取受膜结合型转铁蛋白受体1（Transferrin Receptor 1, TfR1）的表面丰度所限制。可溶性TfR1（soluble TfR1）是临床上鉴别贫血类型的主要标志物。本研究中，研究人员鉴定出iRhoms（无活性菱形蛋白酶家族成员，为表面蛋白酶ADAM17[A Disintegrin And Metalloproteinase 17]的调节性相互作用蛋白）作为底物平台，其结合TfR1并促进ADAM17介导的TfR1蛋白水解释放（TfR1脱落/shedding），从而由iRhom–ADAM17复合物调控TfR1表面水平。值得注意的是，TfR1优先结合促炎性的iRhom2而非iRhom1，且iRhom的胞质侧N端为其关键结合决定区。通过体外CRISPR–Cas9基因敲除（Knockout, KO）及药理学抑制、人原代内皮细胞及离体（ex vivo）人肺切片实验，研究人员证实TfR1是ADAM10与ADAM17的共同底物。功能研究表明，ADAM17依赖的TfR1脱落可减少过量铁摄取；活细胞成像显示TfR1脱落是抵抗铁死亡的保护机制。此外，ADAM17低活性（hypomorphic）小鼠中TfR1脱落减少与血清铁水平升高相关，凸显其在（病理）生理铁稳态中的系统性意义。
论文解读：iRhom–ADAM17复合物及ADAM10介导TfR1脱落调控细胞铁摄取与铁死亡
研究背景与立题依据
铁（Iron, Fe）是生物必需微量元素，参与血红蛋白合成、线粒体呼吸、DNA合成等过程，但过量铁可催化活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）生成并诱发铁死亡（Ferroptosis）——一种铁依赖性的程序性细胞死亡，与感染、自身免疫、肿瘤抑制及神经退行性疾病密切相关，亦为新兴抗肿瘤策略靶点。细胞铁摄取主要由转铁蛋白受体1（Transferrin Receptor 1, TfR1/CD71）介导，其表面水平决定铁摄取速率。TfR1可通过长期转录调控或快速的胞外域蛋白水解脱落（Ectodomain Shedding）产生可溶性TfR1（soluble TfR1, sTfR1；临床用于鉴别缺铁性贫血）。既往药理学提示金属蛋白酶参与TfR1脱落，但具体"脱落酶（sheddase）"身份不明。ADAM10和ADAM17是关键的膜金属蛋白酶（Sheddases），其活性受iRhom1/2（Inactive Rhomboid Proteins 1/2；假蛋白酶，调控ADAM17成熟与底物特异性）调节。本研究旨在阐明TfR1脱落的分子机制及其在铁稳态与铁死亡中的功能。
该研究发表于《Experimental & Molecular Medicine》。
主要关键技术方法
研究人员采用以下关键实验体系与技术：①重新分析先天性iRhom2缺陷患者全血mRNA测序数据集（GSE184876）及系统性红斑狼疮患者数据（GSE112087），评估铁代谢相关基因表达；②构建HEK293细胞iRhom2单KO、iRhom1/iRhom2双KO（dKO）、ADAM10 KO、ADAM17 KO及ADAM10/ADAM17 dKO细胞株，并在iRhom1/iRhom2 dKO中进行iRhom回补表达；③免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, CoIP）及表面CoIP验证TfR1与iRhom/ADAM17相互作用；④ELISA检测培养上清及人离体肺切片（human Precision-Cut Lung Slices, hPCLS）培养上清、小鼠血清中sTfR1；⑤流式细胞术检测细胞表面TfR1水平及Alexa Fluor 488-转铁蛋白（Transferrin, Tf）摄取实验评估铁摄取能力；⑥活细胞成像联合细胞毒性染料检测RSL3诱导的铁死亡敏感性；⑦Western Blot分析总TfR1、ADAM10/17、iRhom及外泌体分离鉴定TfR1释放途径；⑧使用ADAM10/ADAM17广谱抑制剂GW280264X、ADAM10选择性抑制剂GI254023X及PKC激活剂PMA（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate）处理；⑨检测ADAM17低活性（ADAM17ex/ex）小鼠血清铁浓度。
研究结果
Iron metabolism is dysregulated in iRhom2-deficient patients（iRhom2缺陷患者铁代谢失调）
重新分析先天性RHBDF2（编码iRhom2）功能缺失突变患者全血RNA-seq数据发现，铁代谢相关基因表达异常，患者血红蛋白降低，TFRC（编码TfR1）mRNA在杂合及纯合突变者中递增；与慢性炎症状态（系统性红斑狼疮）相比，iRhom2缺陷者铁稳态基因表达谱独特，提示非单纯炎症继发改变。此前iRhom2互作组质谱筛选鉴定到TfR1为潜在互作蛋白，提示iRhom与铁代谢直接关联。
TfR1 interacts with iRhom2 on the cell surface（TfR1与iRhom2在细胞表面相互作用）
CoIP证实内源性TfR1与HA标记的小鼠野生型（wild type, wt）iRhom2共沉淀，且该互作存在于细胞表面（表面CoIP）。利用ER滞留（KDEL/W538S）、高尔基滞留（NOSL/GRIP）及质膜定位iRhom2变体证明：TfR1结合主要发生在分泌通路晚期及质膜；ER和高尔基滞留变体与TfR1结合显著减弱。iRhom1也可结合TfR1但在表面结合量显著低于iRhom2。ADAM10/ADAM17 dKO细胞中该互作仍存在，表明不依赖于ADAM17。非还原条件下证实TfR1以二硫键连接的同源二聚体形式与iRhom2结合。
The cytosolic N terminus of iRhom2 is an important determinant for TfR1 binding（iRhom2胞质N端是TfR1结合的重要决定因子）
系列N端缺失变体（nd197、nd349、nd370、cub）与TfR1共沉淀显著减少；人iRhom2 TOC综合征相关点突变（ndTOC、I186T）不影响结合。磷酸化位点全部突变的iRhom2_pDEAD在iRhom1/iRhom2 dKO回补中结合TfR1能力降低，提示该互作具磷酸化依赖性，且iRhom胞质N端（尤其N端区域及潜在磷酸化位点）为关键结合决定区。
TfR1 is shed by iRhom–ADAM17 complex and ADAM10（TfR1被iRhom–ADAM17复合物及ADAM10脱落）
HEK293细胞组成性释放sTfR1，PMA刺激增加释放（可被GW280264X抑制）。iRhom2 KO及iRhom1/iRhom2 dKO细胞sTfR1（GW敏感部分）释放减少，证明iRhom依赖的ADAM17介导脱落。ADAM17 KO细胞sTfR1升高（伴随ADAM10表面代偿上调），ADAM10 KO细胞sTfR1降低，ADAM10/ADAM17 dKO最低——证实TfR1是ADAM10与ADAM17共同底物，ADAM17可被PMA进一步激活促进脱落。超离实验区分：部分全长TfR1经外泌体（Extracellular Vesicles, EVs）释放，PMA可诱导EV相关TfR1释放（GW不敏感），而蛋白酶剪切的可溶性片段为GW敏感。
TfR1 interacts preferentially with iRhom2 compared with iRhom1（TfR1优先结合iRhom2而非iRhom1）
小鼠及人iRhom1、iRhom2过表达CoIP及iRhom缺陷细胞回补实验一致显示：TfR1与iRhom2结合强于iRhom1，说明iRhom亚型具有底物选择性，iRhom2是TfR1更重要的结合/脱落平台。
ADAM10/ADAM17-mediated TfR1 shedding impacts TfR1 protein levels and Tf uptake（ADAM10/ADAM17介导的TfR1脱落影响TfR1蛋白水平与转铁蛋白摄取）
iRhom KO对TfR1表面水平、总蛋白及Tf摄取无显著影响（可能有补偿）。ADAM17 KO与ADAM10 KO中TFRC mRNA下调（转录补偿），但ADAM10/ADAM17 dKO总TfR1蛋白升高、表面TfR1升高（ADAM17 KO已升高，dKO更甚）。Tf摄取实验显示ADAM17 KO、ADAM10 KO及dKO细胞铁摄取递增（dKO最强），说明脱落缺失→表面TfR1累积→铁摄取增加。
ADAM10 or ADAM17 KO increase susceptibility to RSL3-inducible ferroptosis（ADAM10或ADAM17敲除增加RSL3诱导铁死亡敏感性）
用铁死亡诱导剂RSL3处理，ADAM17 KO与ADAM10/ADAM17 dKO细胞早期（3 h）及长期（24 h）死亡率显著高于野生型；ADAM10 KO短期更敏感但长期与野生型相似。表明ADAM17（为主）及ADAM10依赖的TfR1脱落通过限制铁摄取保护细胞免于铁死亡。
Release of TfR1 ex vivo and in vivo depends on ADAM17/ADAM10 activity（TfR1在离体与在体条件下的释放依赖ADAM17/ADAM10活性）
人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs）组成性释放sTfR1可被GW280264X及GI254023X抑制。hPCLS中PMA上调、GW抑制sTfR1释放。ADAM17低活性小鼠（ADAM17ex/ex）血清sTfR1低于野生型，血清铁水平升高——证实ADAM17（及ADAM10）在体内调控TfR1脱落并影响系统铁稳态。
讨论与结论总结
研究人员在讨论中指出，既往iRhom已知调控ADAM17成熟及TNF-α、EGF受体配体等底物脱落，本研究首次证明iRhoms可作为ADAM17底物（含TfR1、TGF-α、AREG）的结合平台（substrate platform），其中TfR1优先结合促炎性iRhom2，结合依赖iRhom胞质N端（特别是其磷酸化状态），且不依赖ADAM17存在。TfR1脱落主要由ADAM10（组成性）和ADAM17（组成性及PMA可激活）介导，iRhom–ADAM17复合物促进此过程。脱落缺失导致膜TfR1累积、铁摄取增多、对铁死亡敏感；ADAM17低活性小鼠血清sTfR1降低伴血清铁升高，说明该机制具系统生理/病理意义。可溶性TfR1临床诊断值可能受局部iRhom/ADAM10/ADAM17表达与活性影响。此外TfR1还可通过外泌体释放，PMA诱导的外泌体途径不依赖ADAMs。
最终结论： 研究人员鉴定iRhoms为新型ADAM17底物TfR1的结合平台，TfR1优先结合iRhom2，其胞质N端为关键结合决定区；TfR1是ADAM10与ADAM17共同底物，iRhom–ADAM17复合物介导其胞外域脱落；ADAM17依赖的TfR1脱落限制过量铁摄取并抵抗铁死亡；体内外及离体模型证实ADAM10/ADAM17活性调控TfR1脱落及系统铁稳态，为铁相关疾病与肿瘤铁死亡诱导疗法提供新分子靶点。
