《Chemical Communications》：Azide-functionalized SpCas9 enables generation of site-selective and bioactive Cas9-siRNA conjugates
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基因编辑酶SpCas9经工程化后可在其表面展示叠氮基，从而实现叠氮-炔点击偶联。作为概念验证，研究人员将带有还原敏感连接子以及环张力炔四甲基硫代环庚炔亚砜亚胺（TMTHSI）的功能化小干扰RNA（siRNA）偶联至SpCas9的4个不同残基位点，各位点显示出不
基因编辑酶SpCas9经工程化后可在其表面展示叠氮基，从而实现叠氮-炔点击偶联。作为概念验证，研究人员将带有还原敏感连接子以及环张力炔四甲基硫代环庚炔亚砜亚胺（TMTHSI）的功能化小干扰RNA（siRNA）偶联至SpCas9的4个不同残基位点，各位点显示出不同的偶联效率，同时保留了蛋白活性。其中，对539位残基的偶联获得成功，表现出位点选择性，并且在保留SpCas9与siRNA生物活性的同时完成了偶联。
该研究发表于《Chemical Communications》，围绕CRISPR–Cas9基因编辑体系中“编辑工具与调控分子如何实现精确共递送”这一关键问题展开。CRISPR–Cas9，尤其是来源于化脓性链球菌的SpCas9，因其可编程核酸内切酶活性而被广泛视为极具转化潜力的基因治疗工具。然而，SpCas9分子结构复杂，含有多个功能域以及富含精氨酸和赖氨酸的sgRNA识别沟槽，使其在蛋白工程改造上受到明显限制。当前提高编辑效率和调控编辑结局的策略，主要依赖蛋白融合或外加药物分子共递送，但前者通常局限于有限的融合形式，后者则面临细胞内同步递送困难、载体体系复杂化以及制剂条件不兼容等问题。尤其对于核糖核蛋白复合物（RNP）与siRNA的联合递送，脂质纳米颗粒（LNP）的封装条件存在显著差异：siRNA高效封装通常需要较低pH，而这类条件可能导致RNP蛋白失活。因此，若能在SpCas9表面构建可控、位点特异的化学偶联平台，将siRNA直接连接到Cas9上，再在胞内还原环境中释放siRNA，就有望同时提升共递送一致性与功能调控能力。
基于这一背景，研究人员提出利用非天然氨基酸对SpCas9进行表面功能化，在蛋白表面引入叠氮基，建立可用于叠氮-炔点击化学的Cas9-药物偶联平台。研究以小干扰RNA为模型负载分子，选择了经TMTHSI修饰并带有可还原二硫键连接子的siRNA。该设计的核心在于：偶联后SpCas9与siRNA可作为统一复合实体进入同一细胞，而在细胞内谷胱甘肽（GSH）等还原环境作用下，连接子被切断，释放出具有天然活性的siRNA，同时Cas9保留其基因编辑功能。作为概念验证，研究选用了针对萤火虫荧光素酶的siLuc，评估偶联平台在位点选择性、化学可逆性以及双组分生物活性保留方面的可行性。
研究人员首先解决的问题是：如何在不破坏SpCas9活性的前提下，将叠氮基稳定、可及地展示于蛋白表面。为此，研究采用琥珀终止密码子（Amber STOP codon）抑制策略，在重组蛋白表达过程中将对叠氮基友好的非天然氨基酸对叠氮基-l-苯丙氨酸（p-azido-l-phenylalanine, AzF）定点引入SpCas9。候选位点通过计算结构分析筛选，综合考虑蛋白工程耐受性、芳香族残基替换适配性、表面溶剂可及性以及与sgRNA和靶DNA的空间距离等因素，最终选定F196、F539、F682和Y1036四个位点进行替换。实验结果表明，这四种AzF变体均可成功表达、纯化，并能与DBCO-Alexa Fluor 647发生特异标记，证明叠氮基成功引入。同时，体外线性化质粒切割实验显示，四种突变体均保留核酸内切酶活性，说明AzF替换本身未导致SpCas9失活。
在偶联构建阶段，研究人员将siLuc-linker-TMTHSI与4种SpCas9-AzF变体反应，得到对应的Cas9-siRNA偶联物。SDS-PAGE结果显示，不同位点的偶联效率存在差异：SpCas9-196AzF偶联效率较低，而其余3个位点相对较高。但偶联后蛋白活性的保留程度并不一致，其中SpCas9-1036AzF尽管偶联率可观，却几乎不保留核酸酶活性；SpCas9-682AzF保留部分活性；SpCas9-539AzF在偶联效率与活性保留之间表现最佳。因此，F539位点被确定为最优偶联位点，并作为后续深入表征对象。这一结果说明，位点选择不仅影响点击反应效率，也直接关系到Cas9与核酸底物相互作用是否受空间位阻或局部构象变化影响。
为验证该偶联策略是否具备生物环境中的可释放性，研究人员进一步采用5 mM谷胱甘肽处理偶联物。结果显示，处理后蛋白分子量恢复至接近天然SpCas9水平，提示连接子可在模拟胞内还原环境下断裂，实现siRNA释放。这一发现证明，该体系并非简单的永久性表面修饰，而是具备“偶联—共递送—胞内释放”的动态功能逻辑。进一步地，研究通过胰蛋白酶消化结合液相色谱-质谱（LC-MS）对SpCas9-539AzF偶联物进行位点特异性分析。质谱结果确认：F539位点被AzF替换后，相关肽段质量增加41.0014 Da；在偶联并经GSH还原后，该肽段进一步显示358 Da的残余连接基团质量增加，符合设计的释放后化学结构预期。与此同时，含有天然半胱氨酸的肽段未观察到质量增加，说明没有发生非特异性硫醇-炔副反应，进一步证明该偶联反应具有明确的位点选择性。
在功能层面，研究人员分别从siRNA活性和SpCas9活性两方面评估最优偶联物SpCas9-539-linker-siRNA。siRNA功能在同时表达Renilla luciferase（rLuc）和Firefly luciferase（fLuc）的HEK293T报告细胞中检测。结果显示，偶联物与游离siRNA均可显著降低归一化后的fLuc/rLuc信号，而阴性对照不具备此效应。这表明偶联态siRNA在细胞摄取后能够被成功释放，并维持mRNA沉默功能。另一方面，Cas9编辑功能通过eGFP敲除实验进行评价。结果显示，偶联物与天然SpCas9均可实现eGFP敲除，说明在siRNA偶联和胞内递送之后，SpCas9仍保留有效的基因编辑活性。两类功能实验共同证明，该化学平台可在同一构建体中同时保留蛋白编辑活性与RNA干扰活性，从而实现真正意义上的双功能共递送。
研究中还补充进行了一个探索性实验：将靶向不同DNA修复相关因子的siRNA与天然SpCas9共同转染，并考察同源定向修复（HDR）的特异性。结果显示，靶向DNA连接酶4（ligase 4）的siRNA可使HDR特异性提高1.3倍。尽管这部分并非偶联物的直接验证结果，但它为该平台的潜在应用场景提供了实验证据支持，即未来可通过将针对DNA修复、细胞周期或染色质调控通路的siRNA与SpCas9偶联，共同导入目标细胞，以更精细地塑造基因编辑结局。
本研究采用的主要技术方法可概括如下：首先，基于SpCas9晶体结构进行计算筛选，结合表面溶剂可及性和与核酸配体的空间距离，确定可用于非天然氨基酸替换的候选位点；其次，利用Amber终止密码子抑制体系在BL21大肠杆菌中表达含AzF的SpCas9变体，并通过亲和纯化、SDS-PAGE、荧光标记和体外切割实验验证其构建成功及酶活性；再次，采用TMTHSI介导的叠氮-炔点击化学将siRNA定点偶联至Cas9，并通过凝胶分析评估偶联效率与活性保留；最后，结合LC-MS确认位点选择性和GSH诱导释放机制，并在HEK293T双荧光素酶及eGFP报告细胞模型中验证siRNA沉默与Cas9编辑双重生物活性。
以下按论文结果部分的小标题与逻辑进行浓缩解读。
首先，在“在SpCas9表面表达叠氮基且不损失蛋白活性”这一部分，研究人员通过结构指导筛选了4个芳香族残基位点，并成功将其替换为AzF。实验显示，这些变体均可表达纯化、可被DBCO染料特异标记，并保持体外DNA切割活性。该结果表明，在精确筛选位点的前提下，SpCas9表面可被引入适用于点击化学的非天然反应手柄，而不会自动导致蛋白失活。
其次，在“siRNA与不同SpCas9-AzF位点的偶联表现不同”这一部分，研究人员将带有TMTHSI和还原敏感连接子的siLuc偶联到4种AzF变体上。不同位点之间的偶联效率和酶活保留存在明显差异，其中F539位点综合表现最优。这一结果说明，表面暴露程度、局部微环境以及与核酸结合界面的空间关系，会共同决定Cas9偶联平台的实用性。
再次，在“偶联反应具有可逆释放性和位点选择性”这一部分，研究人员证明GSH处理可使偶联物恢复天然蛋白分子量，支持二硫键连接子在胞内还原环境下可断裂释放siRNA。LC-MS进一步确认F539位点的AzF替换、点击偶联及释放后残余基团均符合理论预期，而天然半胱氨酸位点无非特异修饰信号。由此可见，该体系同时具备化学可逆性与位点专一性，是其作为药物共递送平台的核心基础。
最后，在“偶联后SpCas9与siRNA均保留细胞功能活性”这一部分，研究人员在两种HEK293T报告系统中验证了双组分活性。siLuc在细胞内释放后仍可抑制fLuc表达，SpCas9偶联物则仍可实现eGFP敲除。这说明该构建体并非仅在化学层面成功合成，而是实现了功能完整的细胞内协同递送。补充实验还提示，若将该平台用于递送针对DNA修复因子的siRNA，可能进一步改善基因编辑路径选择性。
讨论部分的核心在于，本研究建立了一种以叠氮-炔点击化学为基础的SpCas9表面偶联与释放平台。与既往主要聚焦于直接调控Cas9活性或将Cas9连接至递送载体的化学修饰研究不同，该平台强调“负载分子可位点特异偶联，并在胞内条件下释放”，因此在功能上更适合与影响基因编辑结局的活性分子进行协同应用。研究证明，TMTHSI-连接子化学不仅适用于siRNA概念验证，也原则上适用于任何含伯胺的分子，包括小分子药物、肽段、蛋白片段，甚至与递送载体之间的可释放连接。其重要意义在于，为SpCas9提供了一个兼顾化学精确性、功能保留和胞内可释放性的工程化接口，有望用于解决基因编辑领域长期存在的编辑控制不足与共递送困难问题。
研究结论可译为：研究人员据此得出结论，已成功构建基于叠氮-炔点击反应的SpCas9-药物偶联平台。对SpCas9上的4个芳香族氨基酸位点F196、F539、F682和Y1036进行替换本身并不会使蛋白失活。此前报道的TMTHSI与还原敏感连接子被用于偶联及后续胞内递送的概念验证。4个位点表现出不同的偶联效率与蛋白活性保留程度，其中Cas9-539-siRNA表现最佳。LC-MS证实该反应具有位点选择性，并证明在5 mM谷胱甘肽条件下可发生siRNA释放，这与细胞内浓度范围一致。进一步地，Cas9-539-siRNA偶联物在细胞实验中同时保留了荧光素酶沉默活性和eGFP敲除活性。该平台可通过TMTHSI-连接子化学实现对任何含伯胺分子的偶联及后续释放，从而为基因编辑控制与递送问题提供一种通用而灵活的新工具。
