P2X1受体中央通透通路的结构基础

《Cell Discovery》：Structural basis for a central permeation pathway in the P2X1 receptor

　　

离子通透通路是决定离子通道功能和选择性的关键因素；然而，ATP门控离子通道P2X1受体中离子通透的结构基础，该受体对血小板激活、血栓形成和男性不育至关重要，目前尚不完全清楚。本研究展示了P2X1受体的高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，揭示了一条贯穿整个胞外域的中央离子通透通路，补充了P2X受体家族离子通道结构的现有范式。在该通路中，研究人员鉴定了协调水合钙离子的特定位点，包括一个作为中央前庭顶部选择性滤器的 aspartate 环。研究人员还发现，小分子3,5-双(三氟甲基)苯胺结合于中央前庭顶部，并有效地抑制通过该中央通透通路的阳离子通量。这些发现揭示了P2X1受体中的一个新抑制剂结合位点。这些见解为理性设计靶向中央前庭的P2X受体亚型特异性抑制剂提供了结构框架。

本研究聚焦于ATP门控阳离子通道P2X1受体的离子通透机制这一关键科学问题。P2X受体家族包含七个成员，在生理和病理过程中发挥重要作用，其中P2X1受体主要表达于中性粒细胞、胸腺细胞、血小板和平滑肌细胞，具有快速脱敏特性，并在低细胞外ATP浓度（<1 μM）下表现出对钙离子内流的显著偏好，参与血小板聚集、止血和伤口愈合等关键过程。尽管P2X1受体在血栓形成中的重要性已被认识，但针对该受体的治疗性探索仍处于早期阶段，新抑制剂结合位点的发现以及新型抑制剂的开发仍然重要且亟待探索。现有研究表明，P2X受体的离子通透途径可能涉及中央对称通路或侧向窗孔，但这些路径在离子通透中的具体作用，特别是中央通路与侧向窗孔的相对贡献，尚不完全清楚。为填补这些知识空白，研究人员测定了不同钙离子浓度下P2X1受体的结构，并将结构数据与电生理学数据相结合，以探究中央离子通透通路及其钙离子选择性位点，进而发现新型抑制剂结合位点。该研究成果发表于《Cell Discovery》。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：单颗粒冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）用于解析蛋白质三维结构；全细胞膜片钳电生理技术用于记录离子电流和评估离子选择性；基于结构的虚拟筛选用于发现潜在抑制剂；分子动力学模拟用于分析离子在通道中的运动行为。样本来源于小鼠嗅皮层cDNA文库克隆的野生型mP2X1受体，在昆虫Sf9细胞中表达。

结构解析与ATP结合口袋特征：研究人员利用单颗粒冷冻电镜技术，在1 mM、5 mM和10 mM三种钙离子浓度下解析了全长野生型小鼠P2X1（mP2X1）受体的结构，分辨率介于2.3 ?至3.2 ?之间。值得注意的是，即使在没有外源ATP的情况下，电镜图中仍清晰可见三个ATP分子结合于结构中，这一意外现象在加入ATP水解酶apyrase后依然存在。结构显示，mP2X1受体形成同源三聚体组装，每个原聚体包含两个跨膜螺旋（TM1和TM2），三个TM2共同构成离子可通透通路。TM1位于TM2外缘，呈约17°逆时针旋转，可能参与调控离子通透。

研究人员进一步分析了P2X1受体高ATP敏感性的结构基础。与其他P2X受体亚型相比，P2X1受体的ATP结合腔具有独特特征：R139和K140残基与ATP分子及M214-C217区域形成额外的极性相互作用，这些相互作用为P2X1受体所特有；ATP结合腔的β1折叠、β8折叠及ATP核糖部分排列更为紧密，形成更短更直接的ATP进入路径。突变实验证实，R139A和K140A突变分别使ATP效力降低6倍和13倍，凸显了这些残基在提高ATP敏感性中的关键作用。

钙离子通透性偏好与选择性机制：为评估P2X1受体对钙离子相对于钠离子及其他阳离子的选择性，研究人员利用特定正构口袋突变体（N290A、R292A和K68A）缓慢脱敏的特性，进行了电流-电压关系实验。重点关注的K68A突变体显示出外向整流的电流-电压特征，反转电位接近0 mV。离子替换实验表明，P2X1受体对单价阳离子无选择性，但对钙离子表现出显著更高的通透性，钙钠通透性比值（P_Ca/P_Na）为10.6，与既往报道一致，验证了实验方法并确认了P2X1受体的钙离子通透偏好。

中央离子通路的发现与钙离子选择性位点鉴定：研究人员在不同钙离子浓度下获得了高分辨率冷冻电镜图谱，沿着P2X1受体中央轴追踪了完整的中央通路，包括胞外域顶端的脱水区、上部前庭、中央前庭以及闸门区域。在1 mM钙离子条件下，在H95咪唑基团附近的三重轴处观察到两个连续的离子密度；随着钙离子浓度增加至5 mM，D97形成的阴离子环下方检测到增强的类离子密度，环结构比无钙状态更为紧密；在10 mM钙离子条件下，V344和V347上方出现额外的离子密度。基于这些观察，研究人员提出这些额外密度对应于钙离子，其存在依赖于钙离子浓度。

功能突变实验进一步支持了特定残基在钙离子选择性中的作用：V298S突变降低了钙离子选择性，因为丝氨酸相比异丙基侧链引入了更强的电负性基团；H95A突变破坏了与咪唑基团的双价阳离子协调；D97A或D97K突变显著降低钙离子通透性，双突变D97A/H95A导致选择性进一步丧失。分子动力学模拟显示，钙离子可以从上部前庭经过选择性位点（H95-D97）进入中央和胞外前庭，且不会从胞外前庭区域泄漏。因此，研究人员将D97指定为中央通路的钙离子选择性滤器。此外，V289附近的水分子密度及突变效应表明该区域功能为脱水区，共同构成了钙离子脱水、选择和通透的复杂调控机制。

中央前庭抑制剂的发现与验证：基于中央通透通路和钙离子偏好位点的发现，研究人员针对中央前庭顶部的口袋进行了小规模虚拟对接筛选，从4000个化合物中鉴定出小分子3,5-双(三氟甲基)苯胺（BTFA），其对接评分为-4.838 kcal/mol。电生理实验显示，BTFA对mP2X1受体的混合阳离子电流具有抑制作用，IC₅₀为4.301 μM。钙成像实验进一步证实BTFA能够抑制ATP诱导的Ca²⁺内流。

BTFA结合模式的结构解析：冷冻电镜结构显示，BTFA结合于中央前庭顶部，与预期一致。BTFA结合位点由中央前庭内的极性残基构成，特别是来自三个原聚体的D97以及来自原聚体A的S99和原聚体B的S98。这些残基与BTFA的三氟甲基或苯胺基团形成极性相互作用，稳定结合口袋的形成。单点突变（D97A、S98A和S99A）显著降低了mP2X1受体对BTFA的敏感性，证实了该结合位点的功能性。

BTFA作用机制与选择性：与BX430和BAY-179742阻止P2X4受体激活不同，BTFA结合导致每个原聚体的两个跨膜螺旋（TM1和TM2）协同旋转，使通道闸门扩张但未能达到开放构象。同时，BTFA也不诱导通道关闭，不同于NF449触发的胞外构象重排和跨膜域恢复至关闭状态。因此，该结构可能代表一种中间状态，其中胞质区域部分可见，但受体尚未达到完全激活状态，也不同于脱敏状态。基于此，研究人员提出BTFA通过占据中央通路顶端的中央前庭来抑制离子通透。

选择性实验表明，BTFA对人P2X2和P2X7受体几乎无作用，这两个受体中P2X1受体的关键残基D97要么缺失要么突变；对人P2X3受体也仅有微弱的抑制效应，归因于缺少与S99对应的极性相互作用；在P2X4受体中，E97和N98的较长侧链产生的空间位阻阻止了BTFA结合。BTFA对人P2X1受体的抑制效果约为mP2X1受体的一半，这归因于hP2X1中N98与mP2X1中S98的替换改变了结合相互作用。这些发现表明，由于BTFA结合位点的低序列保守性，该位点是开发P2X受体选择性拮抗剂的有前景靶点。

讨论与结论：P2X受体家族的显著特征在于其胞外中央前庭内存在三个侧向开口。尽管传统观点认为阳离子通过侧向窗孔进入P2X3受体和P2X4受体，再跨膜进入胞质，且P2X受体的钙离子选择性主要由跨膜螺旋胞外端和侧向窗孔附近的酸性残基决定，但本研究为P2X1受体中的离子通透机制提供了新见解。与P2X4受体中D59和D61促进局部阳离子积累不同，P2X1受体中对应的T57和S59为中性残基。重要的是，在P2X1受体中，D97位于中央前庭顶部，发挥钙离子选择性的关键作用，而主要不是作为阳离子聚集位点。综合这些观察，支持了贯穿胞外域的中央通路构成P2X1受体阳离子通透途径的观点，补充了P2X受体通透通路和离子选择性的先前模型。研究结果提示，P2X受体的离子选择性可能源于多个分布式结构元素的协同贡献，其各自的机制和相对贡献有待进一步阐明。

BTFA作为一种结合于中央前庭顶部并剂量依赖性抑制阳离子通量的抑制剂被鉴定出来。该结合位点与P2X4受体中的Gd³⁺结合位点重叠，后者已知可阻断阳离子通透。但与传统通道阻滞剂直接阻塞跨膜孔不同，BTFA结合于胞外域而不引起胞外区域可检测的构象变化，其抑制机制仍有待确定。此外，即使在高浓度下，BTFA也不能完全消除P2X1电流，表明金属离子仍可通过侧向窗孔通透。因此，中央通路与侧向窗孔对整体离子通透和离子选择性的相对贡献值得进一步研究。

本研究观察到所有P2X1受体结构的每个原聚体界面处均存在类脂质密度，位于跨膜域的胞外侧，不直接阻断由V344和V347形成的经典侧向闸门，而可能形成类似闸门的独立结构特征，但其身份因局部图谱质量有限且缺乏直接表征而不完全清楚。

比较结构分析进一步揭示P2X1受体与其他配体门控离子通道如5-HT₃R、nAChR和化学触觉受体具有功能相似性：ATP结合位点与这些通道的配体结合位点空间接近，钙离子选择性位点显示相似的空间特征。综上，研究人员的发现支持了这样一个假说：除了已建立的侧向窗孔之外，贯穿胞外域的中央前庭也参与P2X1受体的阳离子通透。