天然环肽类抗生素结合细菌核糖体E位点

《Nature》：A natural depsipeptide antibiotic binds the E-site of the bacterial ribosome

　　

克服抗生素耐药性危机的一个关键挑战是鉴定新的抗菌化合物¹。尽管由真菌和细菌（特别是放线菌）产生的天然产物在过去80年中是大多数发现抗生素的来源，但由于频繁重新发现已知的药物骨架²，其地位已有所下降。当前的观点认为，产抗生素的放线菌已被过度开采，且缺乏产生新化学骨架的潜力。在此，研究人员证明，通过使用改善的分级分离方法富集先前被忽视的微量产物，即使是研究充分的产抗生素放线菌菌株也能提供具有独特作用模式的新化学骨架。通过对土壤细菌天然产物提取物库进行分级分离，研究人员表明，维氏链霉菌_{Streptomyces rimosus}（已知抗生素土霉素的来源）产生了一种环状depsipeptide抗生素，研究人员将其称为曼科霉素（manikomycin, MKM）。MKM能够杀死多重耐药的肠杆菌科细菌，且不受临床使用抗生素相关耐药性的影响。生化、遗传和结构分析揭示，MKM结合在细菌核糖体大亚基的E位点，阻止tRNA的3'末端进入E位点，从而以序列上下文特异性的方式有效阻碍蛋白质合成的易位步骤。据研究人员所知，MKM是首个靶向核糖体大亚基中关键但未充分探索的E位点的抗菌剂，突显了其作为开发新抗生素先导化合物的价值。

微生物天然产物，特别是源自放线菌的那些，在过去80年中一直是抗菌剂的主要来源。然而，由于频繁重新分离常见的化学骨架以及转向基于靶点的高通量筛选合成化合物，其效用已下降^2,3。尽管多重耐药病原体的出现重新激发了人们对微生物天然产物作为新抗菌剂来源的兴趣⁴，但维氏链霉菌_{Streptomyces rimosus}自1950年以来已知是土霉素的 producer，其基因组中含有丰富的生物合成基因簇（BGCs），但大部分处于沉默状态。为了挖掘这些隐秘的抗生素库，研究人员采用改进的天然产物提取物分级分离策略，对255种细菌菌株的甲醇提取物库进行了筛选，该库主要包含来自不同土壤样本的放线菌，旨在最大化化学新颖性⁶。主要关键的技术方法包括：利用尺寸排阻色谱对S. rimosus WAC 7405菌株的提取物进行分级分离；通过全球天然产物社交网络（GNPS）分子网络分析进行代谢组学指导的去复制；利用高分辨率质谱和1D/2D核磁共振（NMR）光谱确定化合物结构；通过翻译关联重组克隆技术将MKM BGC异源表达；使用单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析MKM-核糖体复合物结构；进行核糖体谱分析（ribosome profiling）研究序列特异性；以及通过引物延伸和亲水相互作用液相色谱-质谱（HILIC-MS）分析rRNA甲基化修饰。

**MKM的鉴定**
研究人员通过分级分离和生物活性指导的纯化，从S. rimosus WAC 7405中分离出一种新的阳离子环状depsipeptide家族，称为MKMs。最丰富的变体是九肽MKM-A。结构分析显示，MKMs通过C端His的羧基与Thr4侧链羟基之间的酯键环化。基因组测序和antiSMASH分析鉴定出负责MKM生产的生物合成基因簇（man BGC），包含非核糖体肽合成酶（NRPSs）ManA和ManB。研究人员将67 kb的MKM BGC异源表达在Streptomyces coelicolor中，证实了BGC的功能。

**MKM抑制细菌翻译**
研究人员发现MKM不破坏细菌膜，而是作用于细胞内靶点。通过亚致死浓度连续传代筛选出的耐药突变体全基因组测序显示，耐药性与核糖体大亚基蛋白bL35（rpmI基因编码）或23S rRNA中的点突变有关。体外无细胞翻译系统实验证实，MKM是细菌蛋白质合成的强效抑制剂（IC₅₀ = 0.6 μM），而对真核生物翻译抑制较弱。

**MKMs结合50S核糖体的E位点**
通过停印（toeprinting）实验和cryo-EM结构分析，研究人员确定MKM结合在50S亚基的E位点，分辨率为2.4 ?。MKM的核心环插入由23S rRNA螺旋H13、H21和H88形成的口袋中，并与rRNA骨架形成大量氢键。结合位点与耐药突变位点（如C249缺失或A2432-A2435缺失，以及bL35蛋白）相邻。MKM的空间位阻阻止了去酰化tRNA的CCA末端（特别是C75和A76）进入E位点。

**MKM抑制翻译的机制**
MKM的结合阻碍了核糖体杂合态（hybrid state）的形成，从而干扰易位步骤。cryo-EM重构显示大部分MKM-停滞核糖体复合物处于易位前状态。核糖体谱分析显示，MKM诱导的核糖体停滞具有序列上下文特异性，在脯氨酸（Pro）密码子处停滞最显著，而在苏氨酸（Thr）密码子处停滞最少。体外实验证实，含有三个Thr密码子的模板比含有Ser密码子的模板更能抵抗MKM引起的停滞。

**MKM自抗性机制**
为了阐明生产者S. rimosus如何避免自毒，研究人员鉴定了与man BGC关联的rRNA甲基转移酶基因manE。表达ManE赋予E. coli对MKM的抗性。分析显示，ManE催化23S rRNA中C2395残基的2'-O-甲基化。结构模型显示，C2395的2'-OH与MKM直接相互作用，而甲基化会引发空间位阻，从而阻止MKM结合。

**MKMs的抗菌效力**
MKMs对革兰氏阴性肠杆菌科细菌（如E. coli和K. pneumoniae）具有选择性抗菌活性，对分枝杆菌也有效，但对其他革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌无效，这可能是由于摄取不足而非翻译抑制失效。MKM对临床分离株中常见的核糖体耐药机制不敏感。在体外人类血液模型和Caenorhabditis elegans感染模型中，MKM显示出有效的抗菌和存活改善作用，且对哺乳动物细胞无细胞毒性。

**讨论**
研究人员指出，通过改进的分级分离，研究人员能够从已过度研究的放线菌中发现新的抗生素骨架，表明微生物基因组中仍有巨大的化学多样性未被挖掘。MKM是首个靶向细菌核糖体大亚基E位点的抗生素，该位点虽保守但未得到充分探索。MKM的作用机制与其他真核生物E位点抑制剂（如环己酰亚胺）不同，它通过空间位阻完全阻断E位点入口，防止tRNA结合，从而抑制易位。MKM的作用具有序列上下文特异性，可能与tRNA的解离动力学或易位速率有关。尽管MKM在小鼠感染模型中由于药代动力学问题（血浆暴露不足）未显示出疗效，但其骨架适合化学修饰以改善药代动力学和毒性特征。ManE介导的rRNA甲基化是生产者自抗性的机制，但也提示了潜在的细菌获得耐药性的途径，可通过修饰MKM分子（如His9）来规避。总体而言，MKM为开发针对多重耐药革兰氏阴性菌的新型抗生素提供了有希望的先导化合物。