《Nature Neuroscience》：Aberrant tau accumulation caused by MAPT mutations induces early pathological changes in axonal transport that are rescued by p38α inhibition
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轴突运输障碍被认为与Tau病(tauopathy，包括额颞痴呆和阿尔茨海默病)的发病机制有关，但其潜在机制和这些缺陷的可逆性在很大程度上仍不清楚。特别是Tau突变、磷酸化及聚集对体内(in vivo)轴突运输的影响尚存争议。研究人员通过在小鼠皮层中使用双光
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轴突运输障碍被认为与Tau病(tauopathy，包括额颞痴呆和阿尔茨海默病)的发病机制有关，但其潜在机制和这些缺陷的可逆性在很大程度上仍不清楚。特别是Tau突变、磷酸化及聚集对体内(in vivo)轴突运输的影响尚存争议。研究人员通过在小鼠皮层中使用双光子成像(two-photon imaging)观察脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)颗粒的轴突运输，发现轴突运输缺陷在Tau病变的早期阶段、缠结形成及神经元死亡之前即于体内出现。从机制上讲，这些损伤是由微管(microtubule, MT)上Tau包被(envelope)增大所致，后者充当了运输的功能性屏障。关键的是，这些缺陷可被MAPK p38α抑制所逆转。综上，本研究证明Tau病变可在体内引起轴突运输的可逆性缺陷，为通过药物干预恢复Tau病中轴突细胞器和 cargoes生理通量(flux)奠定了基础。
论文解读：
研究背景与意义
Tau病(tauopathy)是以微管相关蛋白Tau(Microtubule-Associated Protein Tau, MAPT)异常积聚和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)为特征的神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)和额颞痴呆(frontotemporal dementia, FTD)。Tau蛋白生理状态下结合并稳定微管，参与调节轴突运输(axonal transport)，而轴突运输障碍被认为是Tau病早期事件，但其体内发生时机、由Tau突变/磷酸化/聚集中何种因素驱动、是否可逆及具体机制存在争议。既往体外研究提示Tau影响驱动蛋白(kinesin)与微管结合竞争，但既往体内研究因分辨率不足或观测部位不同得出矛盾结论。此外，p38α MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase α, p38α)在Tau病脑中过度激活并可磷酸化Tau，其在ALS模型中可挽救轴突运输缺陷，但在Tau病中对轴突运输的作用不明。本研究旨在明确FTD相关MAPT突变(P301S/P301L)是否在体内早期引起轴突运输缺陷、其机制是否为微管上Tau包被(envelope)异常增大、以及p38α抑制能否逆转该缺陷。该论文发表于《Nature Neuroscience》。
主要关键技术方法
研究人员采用rTg4510(P301L hTau)和rTg21221(WT hTau)转基因小鼠及同窝对照(CamKIIα-tet transactivator only)；建立小鼠视皮层(V2mm)注射AAV编码轴突靶向GCaMP6(axonal-GCaMP6)及BDNF-mScarlet，植入颅骨窗(cranial optical window)，在体双光子显微镜(two-photon microscopy, 2P)单颗粒分辨率动态观测皮层联合区(LPtA)轴突内BDNF颗粒运输；使用p38α/β抑制剂SB-239063急性给药及选择性p38α抑制剂neflamapimod(原名VX-745/EVP-609)慢性灌胃处理；体外原代小鼠皮层神经元转染WT/P301S/P301L/磷酸缺陷(AP-P301L)/磷酸模拟(E14-P301L)Tau及BDNF-mCherry，进行活细胞成像；免疫荧光观察Tau包被(envelope)大小与频率；相关性光镜电镜(correlative light and electron microscopy, CLEM)观察轴突内细胞器堆积；Western blot检测p-p38、AT8(pS202/pT205 Tau)及sarkosyl可溶/不溶Tau组分；使用kymograph分析运输速度、停顿频率与持续时间。
研究结果
In vivo imaging of axonal transport of BDNF+vesicles in the mouse brain
研究人员建立活体小鼠皮层轴突运输观测体系，证实在V2mm注射AAV可标记LPtA区轴突，BDNF-mScarlet颗粒以前行(anterograde)为主且速度约2.0 μm s-1，适合研究Tau依赖的轴突运输障碍。
Axonal transport is impaired in rTg4510 mice and is restored by p38α/p38β inhibition at early stages of disease
3月龄rTg4510小鼠(高hTau表达、低聚集、无缠结)皮层轴突BDNF颗粒平均运输速度降低、停顿频率增加，而doxycycline下调hTau表达后缺陷消失，rTg21221(WT hTau)无缺陷，证实缺陷由FTD突变而非过表达本身引起。腹腔注射SB-239063急性抑制p38α/β使停顿频率恢复、速度部分正常化，伴随p-p38及AT8(p-tau)水平下降。提示早期轴突运输缺陷可逆且依赖p38α介导的突变Tau磷酸化。
p38α/p38β inhibition enhances axonal transport in rTg4510 mice at later stages of disease
5月龄rTg4510小鼠(存在皮质Tau聚集体/缠结)同样表现BDNF颗粒速度降低与停顿增加，急性SB-239063仍可部分挽救运输并减少sarkosyl-不溶AT8+Tau，表明即便存在Tau聚集，轴突运输缺陷仍具一定可逆性。
Sustained inhibition of p38α enhances axonal transport in vivo in rTg4510 mice
持续5天口服选择性p38α抑制剂neflamapimod较单次SB-239063进一步改善——除平均速度与停顿频率外，最大速度和停顿持续时间也显著恢复，说明持续p38α抑制有叠加益处。
Inhibition of p38α/p38β rescues axonal transport
原代神经元表达hTau-P301S引起BDNF颗粒前行速度下降、停顿增多及移动颗粒数减少，与体内一致；SB-239063处理挽救之。逆行BDNF囊泡及LAMP1+溶酶体相关细胞器运输未受影响，说明缺陷具cargo特异性。无外加seed时P301S不形成明显聚集，与早期病理窗口吻合。
Inhibition of p38α/p38β enhances axonal transport by decreasing mutant tau phosphorylation
表达磷酸缺陷AP-P301L Tau无运输缺陷，磷酸模拟E14-P301L Tau再现P301L缺陷且不被SB-239063挽救；P301L本身缺陷可被SB-239063部分挽救。证明p38α/β抑制剂主要通过降低突变Tau病理性磷酸化恢复轴突运输。
Clusters of mutant tau on microtubules hinder axonal transport
WT与P301S hTau在轴突形成离散高信号区——Tau包被(tau envelope)，P301S包被更大但频率更低。BDNF颗粒更易在P301S包被处停顿，CLEM显示包被邻近有多种细胞器堆积。SB-239063使P301S Tau包被尺寸回缩至接近WT水平但不影响频率。提示突变Tau致包被异常增大构成轴突马达蛋白运行物理屏障，p38α抑制通过去磷酸化减小包被尺寸解除阻碍。
讨论与结论翻译
本研究表明FTD相关Tau-P301S/P301L突变表达在Tau聚集及神经元活性改变之前的极早期即可引起体内选择性轴突运输(主要是BDNF颗粒前行运输)缺陷，该缺陷可被p38α抑制及随之降低的突变Tau磷酸化所逆转。机制上，突变Tau在微管形成尺寸增大之Tau包被(tau envelope)，作为轴突运输障碍性屏障；p38α依赖的Tau磷酸化调控包被大小，磷酸缺陷突变消除运输损害而磷酸模拟突变重现之。轴突运输缺陷在早期出现且可逆，支持针对Tau磷酸化—轴突运输轴的早期干预策略。p38α抑制(含临床阶段化合物neflamapimod)恢复轴突运输，为Tau病提供潜在治疗靶点。
