非人灵长类动物中肠道病毒D68病毒样颗粒疫苗所诱导中和抗体靶向受体结合位点

《Science Translational Medicine》：Neutralizing antibodies elicited in nonhuman primates by an enterovirus D68 virus-like particle vaccine target receptor binding sites

　　

摘要：肠道病毒D68（Enterovirus D68，EV-D68）是小RNA病毒科（Picornaviridae）成员，可引起幼儿周期性呼吸道疾病暴发，并可进展为急性弛缓性脊髓炎（acute flaccid myelitis，AFM）。目前尚无获批的EV-D68疫苗或抗病毒药物。EV-D68病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）可在动物模型中诱生具保护效力的强效中和抗体。本研究报道了研究人员从经EV-D68 VLP免疫的非人灵长类（nonhuman primate，NHP）中分离并鉴定VLP所诱生的单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb），并对其进行表征。研究人员鉴定出5株强效中和mAb，其表位位于由病毒蛋白1（viral protein 1，VP1）五聚体构成的衣壳五重对称轴（fivefold axis of symmetry）附近且相互重叠。mAb 1E11和5H03与VLP复合物的冷冻电镜（cryo–electron microscopy，cryo-EM）结构显示，其表位跨越唾液酸（sialic acid）结合位点及蛋白进入受体——主要促进子超家族结构域含蛋白6（major facilitator superfamily domain-containing protein 6，MFSD6）的结合位点。功能研究发现这些mAb可通过干扰EV-D68生命周期多个步骤（包括促进病毒过早脱壳）发挥中和作用。NHP经VLP免疫所获抗体在小鼠攻毒模型中具预防性保护作用，且与已报道最强效人源mAb效力相当，但单个氨基酸突变可使病毒逃逸中和。结果表明EV-D68 VLP诱生的mAb靶向病毒主要脆弱位点，阐明其中和机制，并支持VLP基疫苗作为EV-D68对策的开发潜力。

论文解读：非人灵长类动物中肠道病毒D68病毒样颗粒疫苗所诱导中和抗体靶向受体结合位点

本文发表于《Science Translational Medicine》。肠道病毒D68（Enterovirus D68，EV-D68）属小RNA病毒科（Picornaviridae），为非包膜病毒，其二十面体衣壳由VP1–VP4四种结构蛋白组成。自1962年发现以来，EV-D68已分化出A（含A1、A2/D）、B（B1–B3）及已灭绝C clade，其中B3和A2/D为当前流行株。EV-D68可致幼儿周期性呼吸道暴发，少数进展为与脊髓灰质炎相似的急性弛缓性脊髓炎（acute flaccid myelitis，AFM），但至今无获批疫苗或抗病毒药物。已知EV-D68初始附着依赖细胞表面唾液酸（sialic acid）及唾液酸化糖蛋白，内吞进入还需主要促进子超家族结构域含蛋白6（major facilitator superfamily domain-containing protein 6，MFSD6）作为进入受体，其结合位点位于衣壳五重对称轴（fivefold axis of symmetry）周围的峡谷区（canyon），该区域亦是强效人源中和单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）如EV68-228的靶位。灭活病毒及病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）疫苗已在小鼠和NHP中诱生交叉中和抗体，但VLP免疫所诱生mAb的具体表位、结构基础及中和机制尚未系统阐明。本研究以VLP免疫NHP并分离mAb，旨在通过结构生物学与功能实验明确VLP诱生抗体的中和表位、作用机制及体内保护效力，并与感染来源人源强效mAb比较。

主要关键技术方法

研究人员采用两只恒河猴（rhesus macaque），先用B3亚型VLP初免及加强，再用A2亚型VLP进行两次异源加强。采集外周血单核细胞（PBMC），以B3和A2 VLP为探针进行多参数流式细胞术分选EV-D68特异性B细胞，通过快速组装转染表达免疫球蛋白（rapid assembly transfection and production of immunoglobulin，RATP-Ig）技术获得mAb并测序。经ELISA结合筛选及微量中和试验初筛后，选取强效mAb进行间接ELISA测定EC₅₀、微中和试验测IC₅₀、生物膜层干涉（bio-layer interferometry，BLI）测结合动力学及表位竞争分箱（epitope binning）。对mAb 1E11和5H03与B3 VLP复合物进行冷冻电镜（cryo–electron microscopy，cryo-EM）结构解析。通过可溶性MFSD6Fc共沉淀、血凝抑制（hemagglutination inhibition，HAI）试验评估受体阻断能力，颗粒稳定性热释放法（particle stability thermal release assay，PaSTRY）检测mAb对病毒脱壳的影响。采用连续传代筛选单抗逃逸突变株并测序鉴定关键衣壳残基。在AG129小鼠（干扰素受体敲除）中进行EV-D68小鼠适应株（B3 Mp20）滴鼻攻毒的被动保护实验，检测血清中和滴度及肺、血、脾脏病毒载量。

研究结果

EV-D68 VLP vaccination elicits potently neutralizing antibodies in NHPs（EV-D68 VLP疫苗接种在非人灵长类中诱生强效中和抗体）

研究人员对两只经B3 VLP初免加A2 VLP异源加强的恒河猴采血，终点中和滴度对B3和A2病毒均维持log₂＞10超过30周。用B3和A2 VLP作探针分选EV-D68特异性IgG⁺B细胞（最高占7%），其中多数同时结合两型VLP。通过RATP-Ig表达并筛选，获60株具中和活性的mAb，选36株进一步分析，其中多数可中和B3，部分可交叉中和A2。

VLP vaccine–elicited EV-D68 mAbs exhibit a broad range of binding and neutralizing activity（VLP疫苗诱生的EV-D68 mAb呈现广泛的结合与中和活性）

纯化后ELISA显示近全部mAb对B3/A2 VLP的EC₅₀≤5 μg/ml。中和试验中多数mAb对B3的IC₅₀＜5 μg/ml，部分对A2中和减弱。选取1A09、1E11、2A09、5H03（对B3/A2中和强于人源EV68-228）及5C10（对两者同等中和）深入表征。BLI显示NHP mAb Fab较EV68-228有更高结合速率和更低解离常数，但结合动力学不能完全预测中和效价。表位竞争实验表明5株NHP mAb均与EV68-228竞争结合，阻断其结合五重对称轴区mAb，说明它们结合相同或邻近EV68-228的表位（五重对称轴周围峡谷区）。

EV-D68 VLP mAbs 1E11 and 5H03 target the fivefold axis of symmetry（EV-D68 VLP mAb 1E11与5H03靶向五重对称轴）

cryo-EM解析B3 VLP?1E11 Fab（2.6 ?）及B3 VLP?5H03 Fab（2.8 ?）复合物结构。1E11结合于峡谷北缘与南缘，重链互补决定区（complementarity-determining region，CDR）CDRH1/2/3接触VP1 BC loop及VP3 C端，轻链CDRL1/2/3接触VP1 C端及VP0 EF loop，表位面积1221 ?²，与EV68-228高度重叠。5H03轻重链取向相对1E11旋转180°，重链结合峡谷南缘并遮蔽峡谷，接触VP1 C端及VP0 EF loop，CDRH3接触VP3 C端，轻链CDRL1接触VP3 C端；不接触VP1 BC loop（该区在不同亚型间变异大），表位面积1090 ?²。二者均结合五重对称轴周围，重叠区域含VP0 EF loop与VP3 C端，且部分覆盖唾液酸结合位点及MFSD6结合区。

Blockade of EV-D68 binding to MFSD6 may not be essential for viral neutralization（阻断EV-D68与MFSD6结合未必是病毒中和的必要条件）

MFSD6Fc共沉淀显示1A09、1E11、2A09、EV68-228、5H03完全阻断VLP与MFSD6Fc结合，而中和mAb 5C10及非中和mAb 5E01不能阻断，提示部分中和mAb可不通过阻断MFSD6结合发挥中和。HAI试验显示所有中和NHP mAb均可阻断B3病毒血凝（阻断唾液酸介导附着）。PaSTRY结果显示1E11可诱导病毒过早脱壳（降低T_R甚至直接致基因组RNA释放），1A09、2A09、5C10、EV68-228呈浓度依赖性降低脱壳温度，5H03及非中和对照则不影响。表明VLP诱生mAb可通过阻断唾液酸附着、同时或单独阻断MFSD6结合、及/或诱导过早脱壳多重机制中和病毒。

Single capsid substitutions enable escape from NHP mAbs（单个衣壳残基替换可使病毒逃逸NHP mAb中和）

用B3病毒连续传代于1E11或5H03中获得逃逸株，测序分别检出VP3 C端D237N（逃逸5H03）和H238R（逃逸1E11），两点相邻但不互相影响对方mAb的中和。D237形成5H03轻链CDRL1 V30氢键，D237N改变电荷破坏结合；H238与1E11 CDRH2 Y53及CDRH3 G102形成氢键，H238R空间位阻破坏作用。对1A09和5C10也筛选出VP2上T139I及T137N+D144G逃逸突变（既往报道抗原位点II）。2020年A2分离株23335因VP1 BC loop变异逃逸1E11（1E11结合BC loop）但对不结合BC loop的5H03仍敏感，说明靶点差异影响交叉中和广度。

EV-D68 VLP–elicited mAbs are protective in a mouse model of respiratory infection（EV-D68 VLP诱生mAb在呼吸道感染小鼠模型中具保护性）

AG129小鼠被动输注3 mg/kg或0.2 mg/kg 1E11、2A09、5H03，24 h后滴鼻攻击小鼠适应B3 Mp20株。3 mg/kg组肺中未检出病毒，血及脾亦无病毒扩散，阴性对照（非中和mAb A9）高病毒载量。0.2 mg/kg低剂量下各治疗组肺、血、脾病毒载量与EV68-228组无显著差异，均显著低于对照组。对数回归显示血清预攻毒中和滴度log₂＝9.3可提供50％肺部保护，log₂＝8.0提供50％脾脏保护，证实VLP诱生NHP mAb被动保护效力等同于最强人源mAb。

讨论与结论总结

研究表明EV-D68 VLP免疫NHP可高效诱生靶向五重对称轴周围峡谷区（含唾液酸及MFSD6结合位点）的强效中和mAb，与感染人源强效mAb表位重叠。其中部分mAb（如1E11）还能诱导病毒过早脱壳。VLP诱生多克隆抗体具交叉clade反应性，且多株mAb识别重叠但略有不同的表位，可降低单一突变导致完全逃逸的风险。分离mAb中大部分具结合但无中和活性，与既往人源EV-D68抗体特征一致，强调中和试验才是保护性相关性的可靠指标。cryo-EM揭示1E11与5H03虽均靶向五重轴但结合取向及接触残基不同，部分mAb（5C10）可只阻断唾液酸附着而不阻断MFSD6即实现中和，说明阻断初始附着本身已足够。单个关键残基（VP3 D237/H238、VP2 T139/T137/D144）突变可致逃逸，提示临床mAb疗法宜联用或依托VLP疫苗引发多克隆反应。NHP VLP诱生mAb在小鼠模型中被动保护效果与人源标杆mAb相当。综上，EV-D68 VLP可于NHP中诱生靶向病毒主要脆弱位点（五重对称轴受体结合峡谷区）的高活性中和抗体，通过阻断附着/受体结合及诱导脱壳等多机制中和病毒并提供体内保护，支持VLP基疫苗作为预防EV-D68呼吸道疾病及AFM的候选策略。