生命科学学院易文/朱强团队开发红光可控亚细胞糖基化精准调控工具

　　

乙酰葡糖胺修饰（O-GlcNAc）是共价连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸羟基上的一种普遍的糖基化修饰。研究表明，O-GlcNAc修饰在调控蛋白质功能方面发挥着关键作用，包括亚细胞定位、蛋白质稳定性和蛋白质之间相互作用等。O-GlcNAc糖基化在细胞内仅由一对酶进行可逆地调控，分别是O-GlcNAc糖基转移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）。该修饰不仅是细胞营养状态的关键感受器，更参与了细胞信号转导的精细调控。然而，由于糖基化修饰具有高度的动态性和异质性，传统的化学抑制剂或基因敲除手段往往缺乏足够的时空分辨率，且难以模拟和调控生理条件下瞬时的修饰动态，这极大地限制了对糖基化在特定微环境中功能的研究。

近日，浙江大学生命科学学院生物化学研究所易文/朱强团队在Cell Chemical Biology杂志在线发表题为“Optogenetic Control of Plasma Membrane O-GlcNAcylation Regulates WNK1 Condensates and Cellular Signaling”的研究论文。该研究基于植物光敏系统，成功开发了红光可控的O-GlcNAc转移酶（OGT）膜转位系统，可在活细胞和小鼠活体水平实现细胞膜O-GlcNAc糖基化对胰岛素信号通路活性的精准操控，更进一步揭示了质膜O-GlcNAc糖基化抑制WNK1-OSR1激酶复合物相分离，进而阻断细胞渗透压应答的新机制。

REDMAP系统是一种基于植物拟南芥光敏蛋白PhyA及其伴侣蛋白FHY1的红/远红光调控的光遗传学工具。在红光（660nm）照射下，PhyA与FHY1两者结合形成二聚体，在远红光（730nm）照射下解离。研究团队利用这一特性，将PhyA与细胞膜定位基序CAAX融合表达，同时将FHY1与OGT融合表达，构建了基于PhyA-FHY1的OGT细胞膜定位系统。在红光刺激下，PhyA-CAAX和FHY1-OGT结合形成复合体并实现了OGT的细胞膜招募（图1A）。研究人员可以像“分子开关”一样，瞬间将OGT招募至细胞膜，诱导局部糖基化。免疫荧光实验表明只有红光（660nm）照射能够诱导OGT的细胞膜定位。紧接着使用远红光（730 nm）照射则可逆转这一过程（图1B）。将含有光遗传系统的元件以腺病毒的方式感染小鼠的肝脏，发现红光诱导的OGT膜定位能够抑制胰岛素信号通路的激活，导致小鼠体内胰岛素抵抗增加（图1D-1E）。

图1、红光可控的OGT膜定位

通过比较光照前后的糖基化以及磷酸化蛋白质组学数据，研究人员发现在红光诱导的条件下WNK1的糖基化修饰显著升高，WNK1激酶下游的效应蛋白的磷酸化水平也有显著的改变，表明OGT的膜定位可能参与调控WNK1信号通路。通过质谱结合点突变实验证实了T1949为WNK1的主要O-GlcNAc糖基化位点（图2A-2B）。功能实验表明，T1949A突变显著增强了WNK1下游信号传导。红光照射诱导的OGT膜定位有效抑制了野生型（WT）细胞中的WNK1下游信号，但对T1949A突变体细胞无显著影响(图2C)。活细胞体积监测实验表明在50 mM山梨醇诱导的高渗应激下，表达T1949A WNK1的细胞表现出比WT细胞更快的体积恢复速率。红光照射显著延缓了WT细胞的体积恢复，而对T1949A细胞则无此效应(图2D)。这表明红光诱导的WNK1 O-GlcNAc糖基化通过抑制WNK1信号通路，进而阻滞了细胞体积的恢复。研究表明WNK1与OSR1结合，形成生物分子凝聚体，从而激活下游信号传导过程。免疫荧光分析显示，红光照射显著抑制了WT细胞中WNK1相分离聚点的形成，而在T1949A细胞中未观察到类似现象(图2E)。此外，研究人员利用化学半合成技术制备的T1949位点特异性O-GlcNAc修饰多肽进行的体外MST实验，发现该位点的糖基化修饰显著削弱了WNK1与OSR1的相互作用 (图2F)。体外相分离实验进一步证WNK1的糖基化修饰抑制了其与OSR1的相分离 (图2E)。综上所述，红光诱导的OGT膜定位通过介导WNK1 T1949位点的O-GlcNAc糖基化，抑制了WNK1与OSR1的相分离(图2G)，从而负向调控WNK1下游信号通路。

图2、红光诱导的OGT膜定位抑制WNK1相分离

总之，该研究开发了红光可控的OGT质膜定位的化学工具，还深入揭示了O-GlcNAc修饰通过抑制WNK1-OSR1相分离来调控细胞渗透压感应的新机制（图3）。该技术可用于其它亚细胞结构定位的糖基化水平调控，为解析亚细胞水平的糖基化功能提供新的研究工具和策略。

图3、 工作模式图

浙江大学生命科学学院****研究员朱强和博士后刘倩玉为论文的共同第一作者。朱强研究员与易文教授为论文的共同通讯作者。生科院王勇研究员参与了这项工作并指导了相分离模拟等实验。该项工作得到了国家重点研发计划，国自然杰青、面上和青年基金，以及浙江大学创新团队建设经费的资助。

原文链接: https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(26)00154-6