基于正交功能注释分析系统筛选中华仓鼠卵巢细胞稳定表达位点

《Gene》：Systematic screening of stable expression loci in Chinese Hamster Ovary cells via orthogonal functional annotation analysis

　　

摘要：开发能够长期、稳定且高效表达重组蛋白的工程化中华仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞系对于工业生物制品生产至关重要。传统的随机整合(random integration)受表观遗传沉默和位置效应(position effect)阻碍，而当前的位点特异性策略受限于稳定的位点库较小。为此，研究人员建立了一种基于理想位点两项核心标准的筛选策略：1)具有持续外源蛋白表达的能力；2)对宿主细胞生理影响最小。通过分析52个已知稳定位点的染色体位置和表达数据，研究人员鉴定出3152个高表达基因。随后的基因本体(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析排除了对核心生长和代谢至关重要的基因，获得252个候选位点。通过评估这些位点在蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络中的介数中心性(betweenness centrality)，优先选择具有潜在基因组稳定性的枢纽基因，进一步精炼为25个理想候选位点。经过40代连续培养，DNA连接酶4样蛋白(DNA ligase 4-like protein, LIG4)、线粒体L-苏氨酸3-脱氢酶(L-threonine 3-dehydrogenase, mitochondrial, LOC100759874)和线粒体重氨基己二酸半醛合成酶(alpha-aminoadipic semialdehyde synthase, mitochondrial, AASS)的增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)阳性率保持在95%以上。本研究建立了一种正交功能富集筛选策略，显著提高了CHO细胞稳定表达位点发现的效率，并为构建适用于工业生产的高度稳定重组细胞系奠定了基础。

论文解读：通过正交功能注释分析系统筛选中华仓鼠卵巢(CHO)细胞稳定表达位点

一、研究背景与意义

中华仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞是生产治疗性重组蛋白尤其是单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的首要宿主细胞。然而，传统随机整合(random integration)外源基因会导致位置效应(position effect)及表观遗传沉默，引起外源基因丢失或表达不稳定；现有位点特异性整合(site-specific integration, SSI)策略虽能降低克隆异质性，但已报道且经工业验证的稳定表达位点库十分有限。目前已通过慢病毒、转座子系统等在CHO基因组中鉴定出超过50个稳定表达位点，但仅有少数位点（如Dop1b）在单个位点上实现千克级抗体产量(0.7–2 g/L)。因此，扩大CHO细胞稳定表达位点库并建立理性的筛选方法是当前亟需解决的问题。该研究拟通过建立正交功能富集筛选策略，从全基因组水平挖掘兼具高转录活性且对宿主生长代谢干扰小的理想稳定表达位点，为构建高稳定重组CHO细胞系提供基础。注：该论文发表于《Gene》。

二、主要关键技术方法

研究人员以文献中已报道的52个已知CHO细胞稳定表达位点为种子，提取其染色体位置及表达量信息，筛选出对应区域内高表达基因(3152个)；采用基因本体(Gene Ontology, GO)及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)功能富集分析排除参与核心生长与代谢的基因，得到252个候选基因/位点；利用STRING数据库构建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络，计算介数中心性(betweenness centrality)筛选网络非核心枢纽基因，最终锁定25个理想候选位点；选取其中3个位点（LIG4、LOC100759874、AASS）通过CRISPR/Cas9介导的位点特异性整合敲入增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)报告基因，进行连续40代传代培养以评估表达稳定性（EGFP阳性率流式检测）。

三、研究结果

Stable expression loci chromosomal information analysis（稳定表达位点染色体信息分析）

将已发表及本研究获得的稳定表达位点映射到CHO细胞染色体上，发现其倾向于聚集于基因密集区域，其中1号染色体含21个位点（17个位于1_0区，4个位于1_1区），2号染色体3个，3号染色体3个，4号染色体7个，6号染色体5个，8号染色体6个，X染色体1个，表明稳定表达位点存在染色体偏好性，且染色体1、2、6、8、9与原始中华仓鼠差异较小，适合作为外源蛋白稳定表达靶区。

Discussion（讨论）

基因在染色体上的空间成簇分布与其高水平表达密切相关，该空间共定位现象为识别CHO细胞中稳定高表达热点提供了基因组学依据，已知高表达基因可作为筛选潜在整合位点的有效参照。研究人员基于已知稳定位点染色质图谱结合转录组数据确定相对保守的高转录区域，再通过GO/KEGG排除与细胞生长代谢密切相关的基因，最后借助PPI网络的介数中心性排除关键枢纽(hub)基因，从而理性筛选出对宿主生理干扰小且具高转录潜力的25个候选位点。经40代连续培养验证，LIG4、LOC100759874及AASS位点的EGFP阳性率均维持在95%以上，证实该正交功能富集筛选策略可有效发掘CHO细胞新型稳定表达位点。

四、结论总结（翻译研究结论部分）

本研究建立了一种正交功能富集筛选策略，通过整合已知稳定位点染色体定位与表达谱、GO/KEGG功能过滤及PPI网络介数中心性分析，从CHO细胞基因组中筛选出25个理想稳定表达候选位点。体外CRISPR/Cas9介导的EGFP报告基因定点整合及40代传代实验显示，LIG4、LOC100759874和AASS位点的外源蛋白表达稳定性（EGFP阳性率>95%）良好。该策略显著提升了CHO细胞稳定表达位点的发现效率，为构建适用于工业生物制品生产的高稳定重组CHO细胞系奠定了基础。