综述：水蛭素通过抑制NF-κB/HK3轴来抑制卵巢癌细胞的增殖和糖酵解过程

《Gene》：Hirudin suppresses ovarian cancer cell proliferation and glycolysis through inhibiting the NF-κB/HK3 axis

　　郭颖|李秋伟|赵芳园|李月|陈桥初|郝松丽
中国黑龙江省哈尔滨市150040，黑龙江中医药大学第四附属医院妇产科

**摘要**
**背景**
卵巢癌（OC）是一种高度致命的恶性肿瘤，而化疗耐药性仍然是有效治疗的主要障碍。本研究旨在探讨水蛭素（hirudin）在卵巢癌中的治疗机制，以期找到克服化疗耐药性的新策略。

**方法**
使用CCK8检测法评估不同浓度水蛭素处理后卵巢癌细胞的存活能力。通过菌落形成实验评估细胞增殖情况，利用伤口愈合实验和Transwell实验分别检测细胞迁移和侵袭能力。为了研究水蛭素对卵巢癌作用的潜在分子机制，整合SuperPred、TargetNet、GeneCards、OMIM和DisGeNET的数据进行了网络药理学分析，以识别与水蛭素和卵巢癌相关的候选靶基因。此外，还进行了双荧光素酶报告基因实验，以进一步评估水蛭素对关键靶基因转录活性的调控作用。

**结果**
研究发现，水蛭素以浓度依赖的方式抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。网络药理学分析表明，核因子-κB（NF-κB）可能是水蛭素的关键分子靶点。其机制在于水蛭素通过抑制NF-κB来下调卵巢癌细胞中己糖激酶3（HK3）的表达，从而降低细胞外酸化率（ECAR）和氧气消耗率（OCR）。

**结论**
本研究为阐明水蛭素在卵巢癌中的抗肿瘤作用提供了理论基础，并提示其作为代谢靶向治疗的候选药物具有潜力。

**引言**
卵巢癌是全球最致命的妇科恶性肿瘤之一，在妇科癌症发病率中排名前三（Kuroki和Guntupalli，2020）。由于早期症状不明显，超过70%的患者在晚期才被诊断出来，这显著影响了治疗效果和预后（Penny，2020）。卵巢癌主要分为两大亚型：上皮性卵巢癌（EOC，占90%）和非上皮性卵巢癌（占10%）（Kuroki和Guntupalli，2020；Penny，2020）。卵巢癌的标准治疗方案是先进行细胞减灭手术，随后进行铂类和紫杉烷类化疗（Kuroki和Guntupalli，2020）。然而，化疗耐药性的发展继续构成治疗挑战，严重影响长期生存率。在这种情况下，靶向药物（尤其是聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂）已成为卵巢癌的有希望的治疗手段（Doig等，2023；Dulaney等，2017）。然而，PARP抑制剂对具有同源重组能力（HRP）的卵巢癌患者的疗效有限（Doig等，2023）。因此，迫切需要开发更有效的治疗策略来延缓疾病进展并改善卵巢癌患者的临床预后。

**水蛭素**
水蛭素是一种由水蛭唾液腺分泌的酸性多肽，是目前已知最强的天然凝血酶抑制剂，在多种疾病的治疗中表现出显著的生物活性（Junren等，2021）。除了其在伤口愈合、抗纤维化作用和糖尿病相关并发症管理中的已知作用外，最近的研究还强调了其作为癌症治疗药物的潜力（Junren等，2021）。越来越多的证据表明，水蛭素对多种恶性肿瘤具有显著的抗肿瘤作用，包括胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌和膀胱癌（Ma等，2023；Zhao等，2022；Shen等，2022）。Ma等人证明，水蛭素通过mTOR信号通路调节自噬有效抑制胶质母细胞瘤的生长（Ma等，2023）。特别是在卵巢癌治疗中，水蛭素显著下调了CDH2、Snail和Vimentin等上皮-间充质转化（EMT）标志物，从而抑制肿瘤细胞增殖（Kou等，2024）。然而，水蛭素抑制卵巢癌进展的精确分子机制仍不清楚。揭示这些机制对于理解其药理作用和开发新的卵巢癌靶向疗法至关重要。

**网络药理学**
水蛭素因其独特的复杂化学结构，在疾病治疗领域展现出巨大潜力（Liu等，2022；Dong等，2016）。全面分析水蛭素与其分子靶点及相关疾病之间的关系，不仅有助于阐明其具体作用机制，还能增强对其潜在治疗靶点的理解，从而扩展其临床应用。网络药理学通过构建复杂的分子相互作用网络，从整体角度系统地揭示药物、基因、蛋白质和疾病之间的关系（Zhang等，2019）。因此，利用网络药理学系统研究水蛭素的机制可以加深对其调控网络的理解，并推动精准医学的发展。

**糖酵解**
糖酵解是癌细胞偏好的主要能量代谢途径，使它们能够快速产生能量以支持不受控制的增殖和存活，从而促进肿瘤的发生和发展（Li等，2023）。最近的研究越来越强调传统中药活性成分的抗肿瘤潜力，这些成分可以干扰糖酵解相关信号通路，阻碍恶性肿瘤的发展。例如，Paris皂苷（Rhizoma Paridis的主要生物活性成分）通过靶向RORC/ACK1信号轴抑制糖酵解，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡（Wu等，2023）。核因子-κB（NF-κB）是炎症、免疫调节和癌症进展中的关键转录因子。研究表明，NF-κB还影响葡萄糖代谢（Zhen等，2024）。Hexokinases（HKs）是糖酵解中的限速酶，人类中有四种同工型：HK1、HK2、HK3和HK4。其中，己糖激酶3（HK3）对葡萄糖的亲和力最高，与糖酵解代谢密切相关。它对维持细胞能量供应和葡萄糖稳态起着重要作用（Wang等，2021；Wu等，2021）。Wu等报告称，脂多糖（LPS）通过激活NF-κB信号通路上调HK3表达，从而增强结直肠癌中的糖酵解，促进肿瘤细胞侵袭和转移（Wu等，2021）。在本研究中，我们采用网络药理学方法系统识别水蛭素在卵巢癌治疗中的潜在靶基因。为了进一步探索其作用机制，建立了卵巢癌细胞模型来模拟体外肿瘤微环境。通过一系列细胞实验，我们旨在阐明水蛭素发挥抗卵巢癌作用的潜在分子机制。本研究为识别水蛭素抗卵巢癌活性的分子靶点和机制途径提供了重要证据，为开发新的治疗药物奠定了理论基础。

**数据收集**
水蛭素的潜在靶基因来自SuperPred、TargetNet和GeneCards数据库。基因标识符使用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）进行标准化处理，排除了没有对应名称的基因（Liu等，2022）。随后删除了重复条目。对于通过TargetNet识别的靶基因，仅保留预测概率（probe）大于0的基因以供进一步分析。

**卵巢癌相关靶基因的收集**
为了全面评估水蛭素在卵巢癌中的治疗潜力，我们首先在缺氧条件下（1% O2）模拟肿瘤微环境，并使用SKOV3卵巢癌细胞系建立了体外模型。用不同浓度的水蛭素（0.1–30 μm）处理48小时后，发现细胞增殖受到明显的剂量依赖性抑制（图1A），估计的半最大抑制浓度（IC50）为2.74 μm。基于这一发现，选择了低于IC50的2 μm浓度进行后续分析。

**讨论**
卵巢癌是一种高度侵袭性的妇科恶性肿瘤，由于其早期临床症状不典型，大多数患者在晚期才被诊断出来，这严重影响了治疗效果和预后（Konstantinopoulos和Matulonis，2023）。因此，迫切需要探索新的靶向治疗策略。本研究首次发现水蛭素显著抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

**伦理声明**
本研究题为“基于PIK/AKEAa信号通路研究水蛭素调节肿瘤缺氧微环境以抑制卵巢癌细胞侵袭和转移的机制”，严格遵守实验室动物福利和传统中药研究的伦理要求。该项目已提交实验室动物管理和福利的伦理审查，并通过了初步审查。

**资金声明**
本研究得到了以下两个来源的资助：
1. 黑龙江省中医药管理局项目（项目编号：ZHY2024-234）——基于PI3K/AKT信号通路研究水蛭素对卵巢癌葡萄糖代谢的影响；
2. 黑龙江中医药大学青年科技创新能力发展项目——研究水蛭素对卵巢SKOV3细胞糖酵解的抑制作用。

**作者贡献声明**
郭颖：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、软件使用、资源管理、方法学设计、实验实施、数据分析；
李秋伟：验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理、实验实施、数据分析；
赵芳园：监督、资源管理、项目管理、方法学设计、实验实施、数据分析；
李月：验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理；

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

**致谢**
不适用。