《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Integrated transcriptomics identifies immune–metabolic dysregulation and candidate diagnostic biomarkers in oligoasthenozoospermia with experimental validation
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研究人员旨在鉴定少弱精症（Oligoasthenozoospermia, OAZ）的候选诊断生物标志物，并表征与精子发生障碍相关的免疫-代谢失调。研究整合了基因表达数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中的GSE45887和GSE4
研究人员旨在鉴定少弱精症（Oligoasthenozoospermia, OAZ）的候选诊断生物标志物，并表征与精子发生障碍相关的免疫-代谢失调。研究整合了基因表达数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中的GSE45887和GSE45885两个数据集，在数据标准化和批次校正后，进行差异表达分析和加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）以鉴定疾病相关基因。功能富集采用基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA）和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进行评估。免疫相关转录组特征变异通过单样本基因集富集分析（single-sample Gene Set Enrichment Analysis, ssGSEA）估算。为鉴定候选生物标志物，采用最小绝对收缩和选择算子（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator, LASSO）、随机森林和支持向量机-递归特征消除（Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination, SVM-RFE）三种机器学习算法筛选核心基因，继而构建逻辑回归、LASSO、随机森林和支持向量机（Support Vector Machine, SVM）诊断模型并进行内部评估。最后建立吸烟和乙醇诱导的小鼠少弱精症模型，采用精子质量检测、组织病理学、转录组学、免疫荧光和蛋白质免疫印迹进行实验验证。
研究结果如下：差异表达分析鉴定出少弱精症中可重复的转录组改变，与WGCNA衍生的关键模块基因取交集后获得86个候选基因。功能富集分析显示这些基因主要与免疫和代谢相关通路有关。GSVA和GSEA证实补体系统、IL6-JAK-STAT3（Interleukin 6-Janus Kinase-Signal Transducer and Activator of Transcription 3）、干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）以及PI3K-AKT-mTOR/mTORC1（Phosphatidylinositol 3-Kinase-Protein Kinase B-Mammalian Target of Rapamycin/mechanistic Target of Rapamycin Complex 1）信号通路呈协同激活，同时精子发生相关程序明显受抑。基于ssGSEA的免疫特征分析提示转录组水平存在潜在的免疫微环境改变，且关键基因与多种免疫相关特征存在相关性。三种机器学习算法进一步分析鉴定出12个核心基因。在测试的分类器中，随机森林模型在内部验证中表现最佳；然而，鉴于样本量有限，观察到的若干模型接近完美的表现应谨慎解读。在小鼠模型中，精子浓度、存活率和活力显著降低，而精子畸形率显著升高，伴随睾丸组织学异常和增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）表达降低。转录组和蛋白水平的验证进一步支持代表性候选基因和通路的失调，为人体转录组学发现提供了生物学相关性支持，而非穷尽性的机制验证。
少弱精症是男性不育最常见的临床表型之一，直接影响自然受孕能力并制约辅助生殖策略的选择。当前临床评估主要依赖常规精液分析，包括精子浓度、活力和形态。尽管这些参数对疾病分级和治疗监测不可或缺，但其仅反映终末表型而非潜在分子驱动因素，对个体化管理的预测价值有限。此外，精液参数受个体差异、环境暴露和取样波动影响显著，导致同一诊断类别内存在较大的生物学异质性。因此，缺乏可靠的分子生物标志物制约了少弱精症的早期风险分层和精准干预。
近年来，转录组学、蛋白质组学和代谢组学等高通量技术被用于揭示男性不育中的分子通路异常，涉及免疫激活、氧化应激、代谢紊乱和精子发生功能障碍等，但独立队列间的可重复性仍有限。具有跨队列稳健性和实验验证支持的候选诊断生物标志物尚未充分建立。许多基于组学数据的预测模型缺乏生物学确认，限制了其转化应用价值。因此，亟需建立整合免疫微环境重塑、代谢信号扰动和精子发生损伤的、经实验验证的生物标志物框架。
睾丸是典型的免疫特权器官，正常的精子发生依赖于血-睾屏障的完整性和精细调控的局部免疫耐受网络。免疫稳态的破坏——由遗传易感性、环境暴露或生活方式相关应激触发——可能导致持续性低度炎症，损害支持细胞-生殖细胞通讯和微环境稳定性。同时，精子发生是能量密集型过程，需要严格调控的脂质代谢、蛋白质合成和生长信号。mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）和PI3K-AKT等通路在维持细胞稳态、自噬平衡和分化动态中发挥核心作用。重要的是，炎症信号与代谢调节之间存在广泛的交互作用：炎性刺激可诱导代谢重编程，而代谢紊乱又可进一步放大炎症反应，形成适应性不良的正反馈环路。已有证据表明，这种免疫-代谢失衡损害精原干细胞维持、减数分裂进程和精子成熟质量，构成男性不育的关键病理基础。然而，针对少弱精症中这一协同失调轴的系统表征尚不完整。
本研究由Panner Selvam、Liu等多位研究人员的前期工作启示，现整合多队列转录组数据集，结合生物信息学挖掘和集成机器学习策略，鉴定少弱精症的候选诊断生物标志物；进一步开展免疫相关转录组特征分析和通路活性分析，以描绘免疫-代谢-精子发生失调的协同轴。关键候选生物标志物在吸烟和乙醇诱导的小鼠模型中进行验证，建立计算预测与生物学表型之间的一致性。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：基于GEO数据库GSE45887（4例正常对照，16例少弱精症）和GSE45885（4例正常对照，27例少弱精症）两个人类睾丸组织转录组数据集的整合分析；采用limma包进行差异表达分析；WGCNA构建基因共表达网络；GSVA和GSEA进行通路富集分析；ssGSEA评估免疫相关转录组特征；LASSO、随机森林和SVM-RFE三种机器学习算法进行特征选择；构建逻辑回归、LASSO、随机森林和SVM四种机器学习诊断模型；建立吸烟联合乙醇暴露4个月的ICR小鼠少弱精症模型；RNA测序进行小鼠睾丸转录组分析；免疫荧光和蛋白质免疫印迹进行蛋白水平验证。
**差异表达基因鉴定与加权基因共表达网络构建**
研究人员对GSE45887和GSE45885数据集进行标准化和批次校正后，差异表达分析在合并数据集中鉴定出122个上调基因和792个下调基因。独立分析显示两个数据集趋势一致。WGCNA构建的加权基因共表达网络中，动态树切割和模块合并后得到多个颜色标记的模块。模块-性状关系分析显示，orangered4模块与少弱精症呈显著负相关（r = ?0.54, P < 0.001），与正常表型呈正相关，提示其在疾病进展中的潜在保护性或下调作用。该模块内模块隶属度与基因显著性呈显著正相关。差异表达基因与WGCNA模块基因的交集分析获得86个重叠基因，作为后续特征选择和机制探索的候选基因。
**基因集富集分析**
基于标准化表达矩阵的GSVA分析显示，疾病组和对照组之间存在明显的通路活性模式分离。差异分析表明，补体信号通路、IL6-JAK-STAT3信号通路、干扰素-γ信号通路和mTORC1/PI3K-AKT-mTOR信号通路整体呈上调趋势，而精子发生相关通路显著下调。GSEA进一步证实，补体系统（NES = +1.72）、IL6-JAK-STAT3信号通路（NES = +1.58）、干扰素-γ反应（NES = +1.80）和mTORC1信号通路（NES = +1.43）在疾病组中呈正富集，而精子发生通路呈强负富集（NES = ?2.62），表明免疫炎症和代谢信号通路在疾病状态下呈方向性一致的激活模式，而精子发生相关程序显著受抑。
**转录组推断的免疫特征模式及相关性分析**
ssGSEA算法估算免疫相关转录组特征变异，结果显示疾病组和对照组之间多个免疫相关特征存在显著差异。与对照组相比，疾病组在活化B细胞、CD8
+ T细胞、效应记忆T细胞和自然杀伤细胞等特征上表现出显著差异，提示少弱精症可能存在转录组水平的免疫微环境改变。Spearman相关性分析显示不同ssGSEA来源的免疫特征之间存在显著的正相关和负相关，T细胞相关特征彼此强正相关，而某些先天免疫相关特征与适应性免疫相关特征呈反向关联，表明协调但异质的转录组水平免疫变异。
**特征基因筛选和机器学习模型构建**
研究人员应用LASSO回归、随机森林和SVM-RFE进行特征选择。LASSO回归通过十折交叉验证确定最优惩罚参数（λ）；随机森林分类器基于平均基尼指数减少量评估特征重要性；SVM-RFE基于SVM模型中的权重迭代剔除特征。三种算法的交集分析揭示12个共享特征基因：ANKRD61、CATSPER4、CYP2C8、FER1L5、FER1L6、GLT6D1、IL1RN、PILRB、PLCD4、UGT3A1、VWA3A和ZNF474。
**机器学习模型的预测性能和临床效用评估**
基于所选特征基因，将样本随机分为训练集和测试集（7:3）。ROC曲线分析显示，LASSO、随机森林和SVM模型的AUC（曲线下面积）均达到1.000，逻辑回归模型AUC为0.944。鉴于样本量有限和内部验证设计，部分模型接近完美的AUC值可能反映乐观的性能估计和潜在的过拟合，应谨慎解读。进一步比较准确率、灵敏度、特异度、精确率、F1分数和Brier分数显示，随机森林模型在当前内部验证设置中综合表现最佳。决策曲线分析显示，随机森林和LASSO模型在较宽的阈值概率范围内较"全部治疗"和"不治疗"策略具有更高的净获益。随机森林模型的校准曲线接近理想参考线，预测概率与观察概率一致性可接受。变量重要性分析确定PILRB、CATSPER4、FER1L6、PLCD4和VWA3A为顶级贡献因子。
**关键基因的差异表达及其与免疫相关转录组特征的关联**
12个关键基因在疾病组和对照组之间均呈显著差异表达，在疾病组中一致下调。Spearman相关性分析构建的基因-免疫特征相关性热图显示，多个关键基因与多种免疫相关特征存在显著关联。FER1L6、UGT3A1、ZNF474和VWA3A的表达水平均与CD56
bright自然杀伤细胞相关特征呈显著负相关，提示这些关键基因可能与少弱精症中的转录组水平免疫微环境改变相关。
**候选关键基因的功能注释和遗传证据整合**
12个关键基因表现出显著的功能多样性：ANKRD61和ZNF474主要参与蛋白-蛋白相互作用和转录调控；FER1L6和FER1L5参与膜运输和膜融合过程；CATSPER4作为精子特异性钙通道复合物亚基，在钙内流调控、精子活力和受精中起核心作用；UGT3A1和CYP2C8参与类固醇激素和脂质代谢；VWA3A和GLT6D1与细胞黏附和蛋白糖基化相关；PLCD4参与钙依赖性信号转导；PILRB和IL1RN发挥免疫调节和炎症抑制作用。遗传调控证据整合显示，这些基因在多个组织中具有稳定的eQTL（表达数量性状位点）、sQTL（剪接数量性状位点）或pQTL（蛋白质数量性状位点）信号。
**少弱精症小鼠模型的表型和组织病理学特征**
为验证模型建立的有效性，研究人员系统评估了正常组（NG）和模型组（MG）的精子质量参数和睾丸组织学特征。显微观察显示，MG较NG精子数量明显减少、形态完整性受损。定量分析证实MG精子浓度、存活率和活力显著降低，精子畸形率显著升高。H&E染色显示NG曲精小管结构完整、生精上皮排列紧密、各级生精细胞有序分布；MG曲精小管结构紊乱、管腔扩张、生精细胞减少、局灶性细胞脱落伴空泡变性。PCNA免疫荧光显示MG中PCNA阳性信号广泛分布于生精上皮基底层和中间层，但MG中PCNA表达明显降低、阳性细胞数显著减少，表明模型成功再现了少弱精症的典型表型。
**关键候选基因的转录组分析和分子验证**
PCA显示NG和MG在三维空间中明显分离，表明整体基因表达谱存在实质性差异。GSEA揭示干扰素-γ和mTORC1信号通路在MG中显著富集，与生物信息学结果一致。RNA-seq分析显示ANKRD61、CATSPER4、FER1L6、PLCD4、UGT3A1和VWA3A在MG中较NG下调，与综合生物信息学分析一致。免疫荧光染色显示PILRB、IL1RN、FER1L5和GLT6D1在NG中强于MG。蛋白质免疫印迹进一步证实CATSPER4、PILRB和IL1RN蛋白水平在MG中显著低于NG。
**讨论**
**主要发现和创新贡献**
本研究整合多队列转录组分析、生物信息学筛选、机器学习建模和体内实验验证，系统表征了少弱精症的分子谱，并构建了以免疫-炎症激活、代谢重编程和精子发生障碍为核心的协同病理框架。基于GSE45887和GSE45885数据集的综合分析，批次校正和标准化后鉴定出高度一致的差异表达特征，WGCNA进一步揭示与疾病表型显著相关的关键基因模块。功能富集分析显示补体信号通路、IL6-JAK-STAT3信号通路、干扰素-γ信号通路和mTORC1/PI3K-AKT-mTOR信号通路在疾病组中整体上调，而精子发生相关程序明显受抑。LASSO回归、随机森林和SVM-RFE联合特征选择鉴定出12个关键候选基因，构建的预测模型在当前数据集内部验证中表现出较强的表观区分能力，随机森林整体表现最佳。建立的吸烟和乙醇诱导小鼠模型再现了精子数量和活力降低、睾丸结构损伤以及关键候选基因下调，与人类转录组结果一致。
**连接免疫-炎症激活、代谢信号失调与精子发生障碍的协同分子框架**
本研究提出少弱精症可能并非由单一分子异常驱动，而是由免疫-炎症反应增强、代谢和生长信号失调以及精子发生程序受抑共同构成的自我放大病理网络。在免疫-炎症层面，GSVA和GSEA一致显示疾病组中补体信号、IL6-JAK-STAT3信号和干扰素反应通路持续激活，ssGSEA提示免疫相关转录组特征发生实质性变异，可能反映睾丸免疫微环境的潜在改变。在代谢和生长信号层面，mTORC1和PI3K-AKT-mTOR通路在疾病组中显著激活，作为细胞能量代谢、蛋白质合成和自噬的核心调控因子，其异常激活常反映代偿性应激反应或代谢失衡。在精子发生功能层面，精子发生相关基因集在患者中显著下调，小鼠模型中PCNA表达降低并存在曲精小管紊乱和生殖细胞丢失的组织学证据。
**关键候选基因的功能模块解读**
整合生物信息学筛选、体内验证和既往文献，关键基因表现出明确的功能模块性。钙信号功能障碍与精子活力及受精能力受损（CATSPER4、PLCD4）：CATSPER4在人和小鼠模型中一致下调，蛋白水平降低经蛋白质免疫印迹证实，模型小鼠精子活力显著下降。膜重塑和囊泡运输异常（FER1L5、FER1L6）：FER1L5蛋白表达降低经免疫荧光验证，组织学显示曲精小管紊乱和生殖细胞排列松散。激素和代谢微环境破坏（UGT3A1）：在人和小鼠模型中均显著下调，提示局部激素代谢受损。免疫抑制和炎症调节受损（PILRB、IL1RN）：两者在疾病组中显著下调，蛋白表达降低经免疫荧光和蛋白质免疫印迹确认，免疫特征分析提示改变的免疫相关转录组模式。
**基因-免疫特征关联的生物学意义**
ssGSEA系统表征显示，多数关键基因与免疫相关转录组特征评分显著相关，PILRB、FER1L5、FER1L6、CATSPER4和UGT3A1与T细胞群、自然杀伤细胞和树突状细胞等适应性免疫相关特征负相关。关键基因的下调伴随系统性的免疫微环境重塑而非单一免疫细胞亚群的孤立变化，提示"基因-免疫微环境"交互轴的存在。
**模型稳健性和转化适用性**
多基因模型在当前分析设置中显示出潜在效用，但缺乏外部验证队列，结果应视为初步证据。候选生物标志物来源于睾丸组织转录组数据，为局部精子发生功能障碍提供生物学信息，但因睾丸组织获取具有侵入性，尚不直接适用于常规临床筛查。未来需验证这些候选基因、其编码蛋白或相关下游分子特征能否在精液、精浆、血液或细胞外囊泡等更易获取的样本中重复检测。
**局限性和未来展望**
本研究存在以下局限性：公开人类睾丸转录组数据集样本量有限，正常对照样本少，可能降低统计效能；体内验证未全面评估所有机制层面，缺乏生殖激素、氧化应激标志物和血-睾屏障完整性检测；无独立外部人类队列验证， near-perfect AUC值可能存在过拟合；免疫相关发现基于ssGSEA推断而非直接细胞测量；小鼠模型可能无法完全捕捉人类少弱精症的病因异质性和多因素复杂性。
**研究结论**
本研究通过整合公共转录组分析和多层次实验验证，鉴定并初步支持了少弱精症的候选分子生物标志物特征。通过在现有数据集中系统优先排序候选基因并检验其体内生物学相关性，研究人员鉴定了与疾病核心分子改变相关的12基因候选panel。该特征在统计区分之外显示生物学一致性、分析策略间的一致性以及转化合理性。免疫相关转录组特征分析与network-based基因选择的整合增强了标志物的可解释性，内部验证为其诊断潜力提供初步支持。动物模型中一致性的转录和蛋白水平变化为该基因panel的相关性提供了生物学支持。这些生物标志物反映了潜在的协同免疫-代谢-精子发生失调模式，将分子分层与病理生理背景相联系，为未来男性不育标准化分子诊断检测的开发奠定基础。需在更大规模、独立且临床更均质的队列中进一步验证，并评估组织来源的候选标志物向微创样本检测的转化可行性。
