钙调磷酸酶依赖转录因子CRZ1是稻绿核菌致病性的重要因子，且直接调控乌斯蒂拉金菌素生物合成

《Phytopathology Research》：Calcineurin-dependent transcription factor CRZ1, an important pathogenicity factor in Ustilaginoidea virens, directly regulates ustilaginoidin biosynthesis

　　

稻绿核菌（Ustilaginoidea virens）作为水稻稻曲病的致病菌，会产生包括乌斯蒂拉金菌素（ustilaginoidins）在内的多种霉菌毒素，这类毒素具有高毒性，会对人类和动物造成危害。已有研究表明，Ugs基因簇是稻绿核菌中乌斯蒂拉金菌素生物合成的关键所在，但目前关于稻绿核菌中乌斯蒂拉金菌素生物合成基因的转录调控机制仍知之甚少。本研究揭示，钙调磷酸酶响应锌指蛋白1（CRZ1）是稻绿核菌中乌斯蒂拉金菌素生物合成的主要调控因子。值得注意的是，研究人员在稻绿核菌中发现了一个全新的CRZ1钙调磷酸酶依赖性响应元件（CDRE），且该元件在包括聚酮合酶1（Pks1）和UgsH在内的乌斯蒂拉金菌素合成基因启动子中高度富集。凝胶迁移实验（EMSA）和染色质免疫沉淀-聚合酶链式反应（ChIP-PCR）分析证实，UvCRZ1能够通过直接结合其启动子中的CDRE来激活Pks1和UgsH的表达。此外，研究人员还发现UvCRZ1对于稻绿核菌的营养生长、分生孢子发生、分生孢子发育、毒力以及霉菌毒素生物合成均具有重要作用。与之相符的是，转录组分析显示，UvCRZ1能够正向调控参与致病过程、次级代谢和能量代谢相关基因的表达。这些研究结果加深了学术界对植物病原真菌毒力和霉菌毒素生物合成（尤其是乌斯蒂拉金菌素产生）潜在调控机制的理解。

稻绿核菌UvCRZ1调控乌斯蒂拉金菌素生物合成及致病性研究解读

研究背景与意义

稻绿核菌（Ustilaginoidea virens）引发的稻曲病是水稻产区最具破坏性的病害之一，不仅会导致水稻产量和品质显著下降，其产生的乌斯蒂拉金菌素（ustilaginoidins，一类双萘-γ-吡喃酮霉菌毒素）还会对人类和动物健康造成严重威胁。尽管前期研究已明确Ugs基因簇（包含Pks1、UgsO、UgsJ、UgsT、UgsL等基因）是乌斯蒂拉金菌素生物合成的核心，且Pks1编码的Ⅰ型聚酮合酶是该过程的关键酶，但Ugs基因簇的转录激活机制始终未被阐明——此前发现的UgsR2编码的假定转录因子并未参与乌斯蒂拉金菌素合成基因的激活。与此同时，钙调磷酸酶响应锌指蛋白1（CRZ1）作为钙调磷酸酶（calcineurin）信号通路的核心靶标，已在多种真菌中被证实参与营养生长、产孢、细胞壁完整性维持、离子稳态及毒力调控，但在植物病原真菌次级代谢调控中的作用仍不明确。在此背景下，解析CRZ1在稻绿核菌中的功能，对于揭示乌斯蒂拉金菌素生物合成的转录调控网络、理解病原菌致病机制具有重要意义。该研究成果发表于《Phytopathology Research》。

主要技术方法

研究人员采用生物信息学手段完成UvCRZ1的同源鉴定与系统发育分析；通过CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建ΔUvcrz1缺失突变体及回补菌株，并利用Southern blot和免疫印迹验证突变体准确性；结合表型观察（菌落生长、菌丝形态、产孢量、孢子萌发率）、水稻接种实验评估毒力差异；通过高效液相色谱（HPLC）定量检测乌斯蒂拉金菌素产量，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析基因表达水平；借助转录组测序筛选差异表达基因（DEGs）并进行KEGG富集分析；利用JASPAR数据库预测新型CDRE（calcineurin-dependent response element）基序，通过凝胶迁移实验（EMSA）和染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）验证UvCRZ1与靶基因启动子的直接结合作用。

研究结果

UvCrz1的鉴定

研究人员以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CRZ1为查询序列，通过BlastX比对从稻绿核菌基因组中鉴定出唯一CRZ1同源蛋白UvCRZ1，其与ScCRZ1序列同一性达64%。结构域分析显示，UvCRZ1包含富含丝氨酸的模体、假定钙调磷酸酶结合位点、核输出信号（NES）、核定位信号（NLS）及两个保守的C2H2型锌指结构域。系统发育树表明，UvCRZ1与绿僵菌（Metarhizium robertsii）CRZ1亲缘关系最近，且两个C2H2锌指结构域在不同真菌物种中高度保守。

UvCrz1缺失降低菌丝生长与分生孢子产量

CRISPR/Cas9技术成功获得3个ΔUvcrz1突变体（经Southern blot确认）。表型分析显示，突变体在PSA平板上的菌落直径显著小于野生型和回补菌株；菌丝隔膜间距缩短，15%的菌丝出现肿胀或扭曲。产孢实验表明，突变体在PSB培养基中的分生孢子产量显著降低，且67%的分生孢子长度长于野生型；孢子萌发实验中，突变体在不同时间点的萌发率均显著低于对照。此外，突变体的分生孢子主要直接在菌丝上产生，而野生型和回补菌株的分生孢子则主要着生于分孢梗上。

UvCRZ1正向调控毒力与乌斯蒂拉金菌素生物合成

水稻接种实验显示，野生型和回补菌株接种的水稻穗平均稻曲球数为8.28±0.68和8.00±0.65，而ΔUvcrz1-11和ΔUvcrz1-13突变体的平均稻曲球数仅为1.4±0.08和1.83±0.24，毒力显著减弱。HPLC检测发现，突变体几乎不产生乌斯蒂拉金菌素，而回补菌株的毒素产量恢复至野生型水平。RT-qPCR进一步证实，突变体中Ugs基因簇关键基因的表达量均显著下调。

UvCRZ1调控毒力与次级代谢相关基因表达

转录组测序显示，与野生型相比，ΔUvcrz1突变体中有587个基因上调、513个基因下调（筛选阈值：P<0.05，|Log₂(FC)|≥1）。KEGG富集分析表明，下调基因显著富集于肌醇磷酸代谢、脂肪酸代谢、淀粉蔗糖代谢、碳代谢、自噬及MAPK信号通路等。随机选取15个毒力和次级代谢相关基因进行RT-qPCR验证，结果与转录组数据一致——突变体中这些基因的表达量均显著下调，且在回补菌株中得到部分或全部恢复。热图分析进一步显示，突变体中与毒力相关的微管细胞骨架基因TubB、组蛋白去乙酰化酶基因Hst1、酪蛋白激酶基因Ck1、SNARE基因Tlg1、自噬相关基因Atg2和Sub1、糖基水解酶家族47基因Mns1、脂肪酸合成基因FabG及真菌特异性转录因子基因Pac2等均显著下调；同时，乙酰辅酶A（acetyl-CoA）合成、非核糖体肽合成酶、聚酮合酶、山梨素生物合成及氨基酸代谢相关基因也呈现差异表达，其中Ugs基因簇的表达下调最为显著。

UvCRZ1通过结合新型CDRE激活乌斯蒂拉金菌素合成基因

由于已报道的真菌CDRE基序在稻绿核菌中不存在，研究人员通过JASPAR数据库预测到稻绿核菌特有的CDRE基序：5’-(A/C)GCC(A/C/T)C-3’。启动子分析显示，Ugs基因簇成员（Pks1、UgsH、UgsT、UgsJ、UgsL等）的启动子区域（-2 kb至起始密码子）均含有1-8个该CDRE基序，且88.69%的下调基因启动子中含有至少1个CDRE。EMSA实验表明，纯化的GST-UvCRZ1蛋白能与Pks1和UgsH启动子的生物素标记探针发生特异性结合，且该结合可被过量未标记冷探针竞争抑制，但不能与突变探针结合。ChIP-qPCR进一步证实，抗HA抗体能显著富集UvCRZ1-HA结合的Pks1和UgsH启动子片段（相较于β-tubulin启动子对照），证明UvCRZ1在体内直接结合这些靶基因启动子。

讨论与结论

讨论部分总结

本研究首次揭示UvCRZ1是稻绿核菌乌斯蒂拉金菌素生物合成的主要转录调控因子。与已报道的其他植物病原真菌（如禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、灰霉病菌Botrytis cinerea等）中CRZ1的功能一致，UvCRZ1同样参与营养生长、产孢及毒力调控。值得注意的是，ΔUvcrz1突变体表现出独特的分孢梗发育缺陷——分生孢子直接在菌丝上产生，这可能与细胞周期基因Wee1的下调有关（Wee1通过磷酸化抑制CDK1，防止细胞过早进入有丝分裂）。此外，本研究发现的稻绿核菌特有CDRE基序（5’-(A/C)GCC(A/C/T)C-3’）不同于其他真菌的经典CDRE，揭示了钙调磷酸酶-CRZ1通路在植物病原真菌中可通过物种特异性基序实现多样化的调控功能。研究还证实，UvCRZ1通过全局调控毒力相关基因（如细胞壁合成、ABC转运蛋白、淀粉蔗糖代谢基因）和次级代谢相关基因（如乙酰辅酶A合成、乌斯蒂拉金菌素和乌斯特洛毒素ustiloxins生物合成基因）的表达，协同影响病原菌的致病能力和毒素产生。

结论部分翻译

基于上述研究结果，研究人员提出了UvCRZ1的作用模型：该转录因子通过直接结合乌斯蒂拉金菌素合成基因（如Pks1和UgsH）的启动子激活其表达，从而促进乌斯蒂拉金菌素的生物合成。此外，RNA-seq分析显示UvCRZ1全局调控参与毒力和次级代谢的基因表达。这些发现强调，进化上保守的钙调磷酸酶-CRZ1通路可采用不同的CDRE基序，在植物病原真菌中发挥调控毒力和次级代谢的多样化功能。