经皮耳迷走神经刺激或迷走神经联合三叉神经刺激对健康人血小板功能及实验室凝血参数(hemostasis parameters)的影响

《Bioelectronic Medicine》：Effects of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation or combined vagal and trigeminal nerve stimulation on platelet function and laboratory hemostasis parameters in healthy human subjects

　　

摘要 背景：创伤性或手术性出血可导致严重的发病率与死亡率。电刺激迷走神经(vagus nerve stimulation, VNS)可在动物模型中减少创伤性出血。VNS靶向脾脏中产生乙酰胆碱的T淋巴细胞，经由α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptors, α7nAChR)升高循环血小板内钙离子浓度。钙离子水平升高可促进组织损伤后血小板活化（预激/priming），从而加速并增强血栓形成以改善止血(hemostasis)。三叉神经刺激(trigeminal nerve stimulation, TNS)同样可减少小鼠创伤性出血，但其机制尚不明确。近期研究人员发现经皮耳神经刺激(transcutaneous auricular neurostimulation, tAN；即耳部VNS与TNS联合)可减少特发性或血管性血友病(von Willebrand disease, vWD)相关月经过多女性的失血量及月经天数。tAN或经皮耳迷走神经刺激(transcutaneous auricular VNS, taVNS)是否能改善血小板功能或实验室凝血参数尚不清楚。 方法：研究人员开展了一项前瞻性、随机、双盲、假刺激对照、单中心、首次人体探索性试验，以评估taVNS或tAN对血小板的预激作用及促凝效应。健康成人受试者在接受taVNS或tAN前先行假刺激(sham stimulation)，随后连续检测血小板及凝血标志物，包括血小板功能分析、凝血酶生成(thrombin generation)、血细胞计数、凝血试验及血栓弹力图(thromboelastography, TEG)。三个及以上时间点比较采用重复测量单因素方差分析(repeated measures one-way ANOVA)继以Bonferroni检验；两个时间点比较采用双尾配对t检验。 结果：taVNS或tAN干预耐受良好，研究期间未见可观察到的不良事件。taVNS或tAN分别经胶原(collagen)或ADP介导的信号通路预激血小板。经TEG测定，taVNS可加速凝血启动(initiation)、传播(propagation)及稳定(stabilization)。给予taVNS或tAN后，全身或局部凝血酶生成、循环白细胞与红细胞计数、血小板计数、凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、部分凝血活酶时间(partial thromboplastin time, PTT)及国际标准化比值(international normalized ratio, INR)均无差异。 结论：上述结果证实taVNS或tAN可预激人血小板，且taVNS可经TEG量化加速凝血动力学。taVNS与tAN值得进一步临床研究，作为创伤性或手术性出血及先天性或获得性凝血病患者的新疗法。 试验注册：本研究注册于ClinicalTrials.gov（注册号NCT05977946；起始日期2023年10月31日）。

论文解读：经皮耳迷走神经刺激或迷走神经联合三叉神经刺激对健康人血小板功能及实验室凝血参数的影响

本文发表于《Bioelectronic Medicine》。

一、研究背景与立项依据

创伤性或手术性出血是平民创伤中可预防的首要死因，非压迫性体腔出血(non-compressible torso hemorrhage)更是战场死亡的主因。现有止血手段（如高岭土纱布、止血带、氨甲环酸(tranexamic acid, TXA)）多为出血后被动应用，对胸腹腔出血无效，且存在血管损伤、组织缺血或远处血栓形成风险。更重要的是，目前尚无临床获批的药物能主动"激活"血小板以增强凝血——相反，多种药物用于抑制血小板治疗血栓性疾病。生物电子医学(bioelectronic medicine)中的植入式颈迷走神经刺激(implantable cervical VNS)已用于难治性癫痫和抑郁，近年扩展至缺血性卒中及类风湿关节炎。前期临床前研究表明植入式VNS可通过胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)，使脾脏产生乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)的T淋巴细胞接触循环血小板，经血小板表面α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)升高胞内Ca²⁺，促使血小板α颗粒分泌，即血小板预激(platelet priming)，从而在猪和血友病A小鼠模型中加速凝血、减少失血。三叉神经刺激(TNS)在小鼠中也显示减少出血但机制不明。近期临床观察发现经皮耳神经刺激(tAN，联合刺激耳迷走神经分支auricular branch of vagus nerve, ABVN及三叉神经耳颞支auriculotemporal nerve, ATN)可减少特发性或vWD相关月经过多者的出血。然而taVNS或tAN能否在人体中改善血小板功能或实验室凝血指标尚未知。为此研究人员开展首次人体(first-in-human)探索性试验进行验证。

二、主要技术方法与研究对象

研究设计为前瞻性、随机、双盲、假刺激对照、单中心探索性试验（ClinicalTrials.gov: NCT05977946）。24名健康成人按1:1随机分为两组——taVNS组（先假刺激耳ABVN区30 min，再活性taVNS 30 min）和tAN组（先假刺激ABVN+ATN区30 min，再活性tAN 30 min）。刺激设备为Spark Volta耳件连接患者控制器，taVNS参数：脉宽250 μs、频率30 Hz刺激区域1(ABVN)，参考电极区域3；tAN参数：区域1(ABVN) 30 Hz + 区域2(ATN) 100 Hz，脉宽250 μs，参考电极区域3；占空比5 min开/10 s关，初始强度2.5 mA可调。基线采血后，于假刺激后10 min、活性刺激后10 min、1 h、2 h采集外周静脉血。检测指标包括：全自动血细胞计数(CBC)；PT、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, aPTT/PTT)、INR、D-二聚体(D-dimer)；血浆凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex, TAT) ELISA（全身血及指端刺伤局部渗血）；流式细胞术检测血小板表面CD42b（血小板标识）、CD62P(P-选择素/P-selectin, α颗粒释放标志)、PAC-1(活化GPIIb/IIIa受体结合物)、CD63(溶酶体相关膜蛋白/dense granule释放标志)，外加胶原(collagen, 5 μg/mL)、ADP(20 μg/mL)或凝血酶(thrombin, 1 U/mL)体外(ex vivo)刺激；血栓弹力图(TEG^?6s系统含PlateletMapping^?)分析凝血启动时间(R time)、凝块形成时间(K time)、α角(α angle)、最大振幅(maximum amplitude, MA)、功能性纤维蛋白原最大振幅(citrated functional fibrinogen MA, CFF MA)及30 min纤溶率(LY30)。统计方法：重复测量ANOVA+Bonferroni多重比较或双尾配对t检验，p≤0.05为差异显著。

三、研究结果

Subject enrollment and allocation（受试者入组与分配）

2023年11月至2024年8月筛选25人，24人符合标准并随机入组（tAN n=11，taVNS n=13），全部完成研究。tAN组平均年龄低于taVNS组，性别、种族、族裔无差异。

Effects of tAN or taVNS on circulating blood counts and clinical coagulation parameters（tAN或taVNS对循环血细胞计数及常规凝血参数的影响）

与假刺激后相比，tAN或taVNS干预后各时点白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)及血小板计数均无明显变化；PT、INR、PTT、D-dimer亦无差异。表明两种刺激不改变循环血细胞数量、内外源性凝血级联功能及全身高凝/纤溶状态。

Effects of tAN or taVNS on systemic and local clot formation（tAN或taVNS对全身及局部凝血酶生成的影响）

全身血及指端刺伤局部渗血的TAT复合物浓度在tAN或taVNS刺激后各时点与假刺激后相比均无差异，说明在此参数下两者不影响浅表毛细血管损伤后的全身或局部凝血酶生成。

tAN or taVNS facilitates platelet activation（tAN或taVNS促进血小板活化/预激）

凝血酶体外刺激下血小板CD62P(α颗粒)、PAC-1(GPIIb/IIIa活化)及CD63(致密颗粒)表达在tAN或taVNS后与假刺激比无差异——提示人血小板对VNS预激的反应不同于小鼠（可能源于种属间蛋白酶活化受体PAR表达/信号差异）。

ADP体外刺激下：tAN组刺激后1 h活化GPIIb/IIIa受体(PAC-1)表达显著高于假刺激(sham=19.7±3.8 vs tAN=25.79±5.57, p=0.035)，CD62P及CD63无差异；taVNS组ADP途径无变化。说明tAN经ADP介导信号通路预激血小板GPIIb/IIIa构象改变。

胶原(collagen)体外刺激下：taVNS组刺激后10 min CD62P(P-selectin, α颗粒)表达显著高于假刺激(sham=2.97±0.56 vs taVNS=4.55±0.75, p=0.03)，PAC-1及CD63无差异；tAN组胶原途径无变化。说明taVNS经胶原-GPVI(glycoprotein VI)介导信号通路预激血小板α颗粒分泌。

综上，tAN选择性预激ADP信号通路的GPIIb/IIIa活化，taVNS选择性预激胶原信号通路的α颗粒分泌，两者预激不同血小板活化通路。

taVNS accelerates clot initiation, propagation, and stabilization kinetics（taVNS加速凝血启动、传播及稳定动力学）

TEG结果显示：tAN组R时间、K时间、α角、CRT MA(citrated rapid TEG MA)、CFF MA、LY30与假刺激比均无差异。

taVNS组：R时间（凝血启动）显著短于假刺激(sham=5.74±0.24 min vs taVNS=4.91±0.24 min, p=0.004)；K时间（凝块传播速度）显著缩短(sham=1.189±0.07 vs taVNS=1.10±0.06 min, p=0.05)；α角（纤维蛋白交联/凝块稳定速率）显著增大(sham=73.78±0.57° vs taVNS=75.53±0.47°, p=0.02)；CRT MA（血小板+纤维蛋白原总凝块强度）、CFF MA（单纯纤维蛋白原贡献）、LY30（纤溶率）及血浆纤维蛋白原浓度均无变化。血小板图(PlateletMapping)中HKH MA、ActF MA、ADP MA、花生四烯酸(arachidonic acid, AA) MA及各通路聚集%/抑制%均无差异。

表明taVNS——而非tAN——加速凝血启动、凝块形成速度与稳定速率，但不改变最终凝块最大强度及纤溶，也不改变凝血因子水平，其效应源于预激血小板创造更有利的促血栓微环境。

Safety（安全性）

唯一报告不良事件为采血时轻度头晕（电极已戴但刺激未启动），自行缓解，判定与干预无关。taVNS和tAN在本研究中耐受良好，无可观察不良事件。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出：本研究首次在人体证实taVNS和tAN可预激血小板——taVNS经胶原介导α颗粒分泌通路，tAN经ADP介导GPIIb/IIIa活化通路；仅taVNS显著缩短TEG R时间、K时间并增大α角，加速全血凝血启动、传播与稳定，这与前期猪VNS研究中RoTEG(rotational thromboelastography)缩短12%相仿（本研究taVNS缩短R时间约15%），且不伴血小板计数、凝血因子、全身凝血酶生成或纤溶的改变，提示效应为血小板定性功能(qualitative platelet function)优化而非定量或凝血级联改变。tAN未在TEG中显示动力学改变，可能与刺激时长较短或采血时机有关，或其止血效益独立于加速凝血动力学（与其在月经过多中减少出血但前期动物VNS未见K/α角改变相符）。两种刺激均未引起常规凝血参数偏移或高凝征象(D-dimer不变)，提示生理性预激而非病理性高凝。局限性包括样本量小、女性居多、未预设主要终点、多重比较假阳性风险、健康人未能验证临床止血终点、部分TEG因超时排除、仅短期安全性监测等，需更大样本及出血/手术/产后出血/凝血病人群验证。

结论（翻译）：

本研究结果表明，taVNS或tAN可预激人血小板，且经血栓弹力图(thromboelastography, TEG)量化证实taVNS可加速凝血动力学（凝血启动、传播及稳定）。taVNS和tAN值得进一步开展临床试验，作为创伤性或手术性出血及先天性或获得性凝血病（如血友病A、血管性血友病(von Willebrand disease, vWD)）的潜在治疗手段。