《Journal of Biomedical Science》：Exploring CAR cell therapies beyond CAR-T for myeloid malignancies
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嵌合抗原受体（CAR）-T细胞在多种血液系统恶性肿瘤中已展现出显著疗效，但在急性髓系白血病（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）等髓系恶性肿瘤中的应用仍十分有限，迄今尚无获FDA批准的相关产品。这一进展受限主要源于疗效挑战与安全性顾虑的双重制约：CAR-T细
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞在多种血液系统恶性肿瘤中已展现出显著疗效，但在急性髓系白血病（AML）、骨髓增生异常综合征（MDS）等髓系恶性肿瘤中的应用仍十分有限，迄今尚无获FDA批准的相关产品。这一进展受限主要源于疗效挑战与安全性顾虑的双重制约：CAR-T细胞向骨髓的归巢与持久性较差，对白血病干细胞（LSCs）的杀伤活性有限，且依赖CD33、CD123等在正常造血干/祖细胞上也有表达的抗原，易引发显著的靶上脱瘤毒性。鉴于这些局限，研究重心正逐步转向替代性CAR工程免疫细胞，包括CAR-自然杀伤（CAR-NK）细胞、CAR-恒定自然杀伤T（CAR-NKT）细胞及CAR-巨噬细胞（CAR-Ms）。这些平台具备独特优势，如固有抗肿瘤活性、差异化的组织归巢特性、移植物抗宿主病（GvHD）风险降低，以及更具安全性的抗原识别谱，有望突破CAR-T细胞面临的瓶颈。本综述系统阐述了常规CAR-T细胞应用于髓系恶性肿瘤的核心挑战，解析新兴替代性CAR细胞平台的技术特点，并探讨其生物学特性与工程化策略如何为这类难治性肿瘤患者提供更安全、有效且可及的治疗选择。
引言
髓系恶性肿瘤是一类起源于骨髓（BM）并破坏正常造血功能的疾病，主要包括急性髓系白血病（AML）与骨髓增生异常综合征（MDS）。标准治疗方案通常以柔红霉素、阿糖胞苷等强化疗联合异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）为主，近年来去甲基化药物（HMAs）、单克隆抗体、抗体偶联药物（ADCs）及靶向抑制剂的应用进一步拓展了治疗选择。然而患者长期预后仍不容乐观，AML与MDS的5年生存率分别仅为约37%与30%。现有疗法的局限性主要来自耐药与疾病复发，而骨髓内恶性原始细胞的持续存在，尤其是具备自我更新能力并可维持疾病进展的白血病干细胞（LSCs），是实现持久缓解的关键障碍。因此，开发能够有效靶向骨髓驻留LSCs、满足髓系恶性肿瘤巨大临床未满足需求的创新治疗策略迫在眉睫。
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是髓系恶性肿瘤领域极具潜力的免疫治疗方法。CAR是人工设计的基因工程受体，可重定向T细胞识别特定肿瘤相关抗原，增强其对恶性细胞的活化与杀伤效应。AML与MDS的临床前与早期临床试验已探索了CD33、CD123、CD7、CD70、Fms样酪氨酸激酶3（FLT3）、C型凝集素样分子-1（CLL1）等多个靶点。但与CD19阳性B细胞恶性肿瘤及BCMA阳性多发性骨髓瘤（MM）中的成功表现相比，CAR-T细胞在髓系恶性肿瘤中的临床结局仍不尽如人意。其核心限制包括：CAR-T细胞向骨髓微环境的归巢能力差、体内持久性不足；LSCs及其他恶性亚群可通过下调靶抗原逃逸免疫监视；CD33、CD123等多数候选抗原同时表达于正常造血干/祖细胞（HSPCs），导致严重的靶上脱瘤毒性和 prolonged 骨髓抑制；此外自体CAR-T制备工艺复杂、患者T细胞质量异质性强，而异体应用又面临GvHD风险。因此，亟需开发兼具现货供应属性、更低毒性、更高恶性细胞靶向特异性并能保护正常造血组分的下一代细胞疗法。
替代性CAR工程免疫细胞正成为突破传统CAR-T局限的重要方向。CAR-NK细胞可利用NK细胞的固有杀伤能力与细胞因子分泌功能，且同种异体应用GvHD风险极低，适合开发为通用型现货产品。CAR-NKT细胞结合了CAR的靶向特异性和NKT细胞的独特免疫调节特性，能够高效归巢至肿瘤部位、调控肿瘤微环境（TME）并降低同种异体反应性。CAR-Ms则通过增强肿瘤细胞吞噬能力、重塑免疫抑制性TME、促进适应性免疫应答招募发挥抗肿瘤作用。这些下一代CAR工程免疫细胞从不同机制层面弥补了CAR-T的短板，为解决髓系恶性肿瘤治疗困境提供了多元技术路径。
本综述围绕限制传统CAR-T治疗AML与MDS的核心障碍——骨髓归巢能力不足、异质性白血病干/祖细胞清除效率有限、抗原与正常造血干/祖细胞重叠、持久性与毒性难以平衡、通用型产品开发难度大——系统梳理了各平台的生物学特性与工程化策略，明确CAR-NK、CAR-NKT与CAR-M并非可互换的替代方案，而是具有独特生物学机制的差异化治疗系统。
髓系恶性肿瘤治疗中的非CAR-T类CAR细胞疗法临床前研究
CAR-NK细胞
NK细胞是重要的天然免疫效应细胞，可通过活化受体与抑制受体的信号平衡快速识别并清除病毒感染细胞与恶性细胞，其活化不依赖抗原特异性与MHC限制性，关键活化受体包括NKG2D、NKp30、NKp46、2B4、CD16等。NK细胞的独特生物学特性赋予其显著细胞治疗优势：同种异体NK细胞不会介导GvHD，支持开发可规模化生产、储存并快速临床应用的现货型产品，解决了自体CAR-T成本高、制备周期长等痛点。同时CAR-NK可结合固有杀伤活性与抗原特异性靶向，在增强抗髓系恶性肿瘤效力的同时潜在降低靶上脱瘤毒性。临床前研究显示，不同来源的CAR-NK细胞均表现出稳健的抗白血病活性与良好安全性特征，通过细胞因子支持或基因编辑可进一步优化其体内持久性与扩增能力。
外周血来源NK细胞经慢病毒载体介导CD33-CAR修饰后，在AML异种移植模型中可有效降低肿瘤负荷、阻断骨髓白血病细胞植入，且未观察到细胞因子释放综合征（CRS）、体重下降、行为异常或GvHD等毒性反应。基于CliniMACS Prodigy系统的自动化规模化生产工艺可实现临床级CD33特异性CAR-NK制备，细胞表型与杀伤功能与小体系产品保持一致。针对HLA-E-NKG2A免疫检查点的编辑是提升CAR-NK功能的重要策略，CRISPR/Cas9敲除NKG2A编码基因KLRC1可阻断抑制性信号，使CAR-NK细胞在AML细胞暴露后仍保持活化与成熟转录特征，显著提升抗白血病效能。
CAR结构设计与功能强化是另一研究重点。以CD123为靶点的CAR-NK研究中，含2B4.ζ或4-1BB.ζ信号域的构建体表面表达水平更高，体外抗AML活性更强；其中2B4.ζ CAR-NK在体内显示出优于未转导（UTD）NK与4-1BB.ζ CAR-NK的抗白血病效果，但受限于体内持久性不足，疗效呈短暂性。共表达IL-15可改善CAR-NK的体内扩增与抗肿瘤效力，但伴随系统性毒性升高，提示细胞因子工程需在效力与安全间寻求平衡。其他靶点研究同样验证了CAR-NK的优势：CD123 CAR-NK在小鼠模型中不仅高效清除AML细胞，且未出现CD123 CAR-T导致的正常CD34+造血干细胞的严重耗竭，内皮毒性也显著降低；共分泌抗CD16抗体的双功能CD33 CAR-NK通过Fc受体交联进一步增强NK杀伤效率；蛋白酶体抑制剂硼替佐米、卡非佐米预处理可降低AML细胞表面Ⅰ类HLA表达、上调应激相关蛋白，提升其对CAR-NK杀伤的敏感性；靶向CLL-1的CAR-NK因CLL-1高表达于白血病细胞而几乎不表达于正常HSPCs，在显示强效杀伤活性的同时未表现出对HSPCs的毒性，其中IL-2装甲版本较IL-15版本在体内肿瘤负荷降低方面表现更优；非病毒piggyBac转座子系统介导的NKG2D配体靶向CAR-NK共表达IL-15，也在体内外验证了其抗白血病活性与制备成本优势；针对NPM1突变产生的新抗原的TCR样CAR，结合IL-12、IL-15、IL-18诱导的细胞因子诱导记忆样（CIML）NK表型，可在AML异种移植模型中实现持久的抗白血病效果。
不同来源的NK细胞各有优劣：外周血NK保留了天然生物学特性与杀伤活性，但供者间异质性大、扩增能力有限、转导效率不稳定；脐带血NK来源可及性好，适合细胞库建设，但需大量体外扩增与成熟诱导，且靶向髓系抗原时需严格评估造血毒性；NK-92细胞系产品可重复性高、易于基因编辑，但因属转化细胞系，输注前需辐照处理，限制了体内持久性；iPSC衍生NK细胞则兼具规模化生产能力与多重基因编辑兼容性，通过CD33特异性CAR、高亲和力不可切割CD16（hnCD16）、IL-15、CD38敲除的四重改造，不仅增强了直接杀伤与抗体依赖性细胞毒性（ADCC），还可与达雷妥尤单抗产生协同效应，是极具前景的现货型平台。
CAR-NKT细胞
NKT细胞是一类兼具αβ T细胞与NK细胞特征的特化T细胞亚群，根据TCR repertoire可分为Ⅰ型（恒定NKT，iNKT）与Ⅱ型，其中iNKT表达半不变TCRα链，可被α-半乳糖神经酰胺（α-GC）强烈激活。过去五年，CAR-NKT已在血液瘤与实体瘤中验证了 potent 抗肿瘤活性。近期一项临床研究中，靶向GD2并共表达IL-15的CAR-NKT治疗儿童复发/难治神经母细胞瘤，展现了良好的可行性与初步疗效，为其临床转化提供了关键依据。
在髓系恶性肿瘤领域，通过临床导向培养方法从基因工程造血干/祖细胞（HSPCs）分化的CD33靶向CAR-NKT细胞，展现出多项适配骨髓驻留病灶的特性：高表达CXCR4、CCR5趋化因子受体，使其具备向骨髓定向迁移的能力；可通过CAR、TCR与天然杀伤受体（NKR）三重机制发挥杀伤作用，不仅能靶向CD33阳性细胞，还可通过TCR识别CD1d呈递的脂质抗原，清除CD33低表达或阴性LSCs，克服了传统CD33 CAR-T对抗原丢失亚群的逃逸问题；去甲基化药物（HMAs）可显著上调AML细胞CD1d表达，进一步增强TCR介导的杀伤效应。临床前研究中，该细胞在多种AML异种移植与患者来源异种移植（PDX）模型里均表现出卓越的杀伤效力，且安全性特征优异：无GvHD发生、CRS发生率低、长期毒性可控、对造血前体细胞的靶上脱瘤毒性低于CAR-T与部分CAR-NK产品。与CAR-NK相比，CAR-NKT的多模式识别能力使其在AML/MDS的抗原异质性背景下更具优势，但当前其在髓系恶性肿瘤的研究仍以临床前为主，需进一步明确体内持久性、给药方案、生产工艺标准化及疗效预测生物标志物等关键问题。
CAR-Ms
CAR-Ms通过工程化CAR信号重定向巨噬细胞的吞噬功能，兼具抗原提呈能力，可重塑TME并诱导全面抗肿瘤免疫应答。在HER2阳性实体瘤模型中，CAR-Ms与PD-1阻断剂联用可增强肿瘤消退、延长生存并推动TME向免疫刺激状态转化，显示了其与免疫检查点抑制剂的协同潜力。对于髓系恶性肿瘤，巨噬细胞本身是骨髓微环境的天然组分，具备吞噬、细胞因子分泌、抗原提呈、局部免疫调控等淋巴细胞不具备的功能，理论上可更精准地作用于骨髓驻留AML原始细胞与LSCs。但目前直接针对AML/MDS的CAR-M研究证据十分有限，绝大多数数据来自实体瘤模型，因此其临床应用仍属于假说探索阶段。
CAR-M转化的核心挑战包括：需维持稳定的M1样表型以确保吞噬与抗原提呈功能；巨噬细胞增殖能力有限，可能需重复给药或局部重编程策略；生产工艺的标准化程度远低于CAR-T与CAR-NK，细胞来源、分化方案、基因转导方法、效力检测与放行标准均有待统一；系统性激活巨噬细胞可能引发炎症毒性，尤其在造血微环境中需警惕对正常造血的非预期损伤。未来体内单核细胞/巨噬细胞CAR工程是极具吸引力的方向，纳米颗粒、病毒与非病毒基因编辑平台可直接在体内重编程巨噬细胞，规避体外制备壁垒，利用巨噬细胞组织驻留特性实现精准靶向，若成功转化将极大拓展髓系恶性肿瘤的治疗选择。
髓系恶性肿瘤治疗中的非CAR-T类CAR细胞疗法临床格局
目前尚无CAR-NKT或CAR-M疗法进入AML临床评估，但已有多个CAR-NK产品推进至早期临床阶段。CAR-NKT与CAR-M在髓系领域的临床空白，部分源于对其体内持久性、扩增规律与安全性的认知不足，以及规模化生产工艺的挑战。其他适应症的临床数据为这两类平台提供了参考：靶向GD2的CAR-NKT治疗神经母细胞瘤的Ⅰ期试验验证了其在人体中的可行性与耐受性；靶向HER2的自体CAR-Ms也在实体瘤中完成了首次人体给药，初步探索了输注安全性、组织分布与免疫调节活性。
CAR-NK的临床探索已取得初步结果：首个人类CD33 CAR-NK-92细胞治疗复发/难治AML试验中，患者接受最高5×109细胞剂量输注，耐受性良好，未观察到严重不良事件，但未显现明确临床疗效。脐带血来源CD33 CAR-NK的Ⅰ期试验则显示更积极的信号：患者经氟达拉滨（30 mg/m2）联合环磷酰胺（300–500 mg/m2）清淋后接受单次或多次输注，未发生免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）或GvHD，≥3级不良事件仅为血液学毒性，中位随访125天（范围45–258天）时，10例患者中有6例（60%）在第28天达到微小残留病阴性完全缓解（MRD-CR）。该研究证实CD33 CAR-NK在AML中具有可接受的安全性，并具备诱导完全缓解的潜力，但同CAR-T类似，疾病复发仍是主要失败原因，推测与CAR-NK体内扩增与持久性不足有关，仅1例患者获得长期生存。
当前临床前模型的局限性
现有临床前研究高度依赖免疫缺陷异种移植与PDX模型，这类模型虽可用于评估直接抗白血病活性与初步安全性，但无法完全模拟人类免疫环境，缺乏完整的适应性免疫与天然免疫组分，难以预测宿主抗移植物排斥、髓系介导的免疫抑制、细胞因子驱动毒性、内源性免疫活化以及输注细胞与骨髓微环境的相互作用，而这些因素正是决定CAR-NK、CAR-NKT与CAR-M体内效力与持久性的关键。临床研究中观察到的CAR-NK持久性不足与复发问题，凸显了这一转化鸿沟，也提示需要开发更能模拟人类病理生理的骨髓模型，以更准确地预测临床结局。
CAR-NK、CAR-NKT与CAR-M疗法的未来发展
细胞因子工程是提升效力与持久性的核心策略。对于CAR-NK，IL-15或IL-2的异位表达可改善体内存活、扩增与杀伤活性，但需优化剂量、释放动力学与调控元件以降低系统性毒性；联合NKG2A阻断或共刺激信号（如2B4.ζ）可进一步增强功能。CAR-NKT同样可从IL-12、IL-15、IL-18、IL-21的支持中获益，诱导记忆样表型并延长体内存活，且不会诱发GvHD，是其区别于传统T细胞的重要优势。CAR-Ms则可通过GM-CSF、IL-12、IL-15等细胞因子极化向M1样表型，增强吞噬活性与内源性免疫招募能力。但所有细胞因子工程都面临效力与可控性的平衡难题，未来需引入调控表达系统、膜结合型细胞因子、局部递送、自杀开关或药理可控回路，以实现安全增效。
联合治疗是克服免疫逃逸的关键方向。CAR-NK可与抗PD-1/PD-L1抗体、化疗药物、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、溶瘤病毒等联用，通过增强持久性、逆转免疫抑制微环境与交叉激活适应性免疫提升疗效。CAR-NKT与CAR-M也可通过与检查点阻断、细胞因子支持、表观遗传调控剂联用，放大其双重靶向与微环境重塑优势。疫苗协同策略中，针对NKT细胞TCR的抗原呈递可特异性增强CAR-NKT功能；而直接通过CAR识别激活细胞的策略则适用于所有CAR工程免疫细胞。去甲基化药物（HMAs）作为AML/MDS的标准治疗药物，已被证实可上调AML细胞CD1d、NKG2D配体等免疫识别分子的表达，与CD33 CAR-NKT联用可显著增强肿瘤控制；同时HMAs可上调LSCs的CD70表达，为CD70靶向CAR疗法提供了协同理论基础，有望选择性清除LSCs、克服耐药。
抗原选择与抗原逃逸是需要长期应对的挑战。CD33、CD123等传统靶点因在正常HSPCs上的表达存在狭窄治疗窗，不同平台均需警惕靶上脱瘤毒性：CAR-T因长期持久性风险毒性最显著，CAR-NK与CAR-NKT虽可通过有限存活降低长期毒性，但仍需通过正常HSPCs集落形成实验、长期造血重建研究等进行严格评估。CAR-M的吞噬作用也可能对正常造血细胞造成非预期损伤。为减少抗原逃逸，双靶点或多靶点CAR、逻辑门控识别系统、LSCs相关抗原组合靶向、表观遗传预激增敏等策略将成为重点，HMAs的应用正是增敏肿瘤免疫原性的典型范例。
通用型现货应用是这类平台的核心竞争力。NK细胞、NKT细胞与巨噬细胞本身不介导GvHD，无需像CAR-T那样敲除TCR，从而保留了天然效应功能。iPSC与HSPC衍生平台进一步结合了干细胞的可扩展性：可通过多重基因编辑敲除B2M、CIITA以消除HLAⅠ/Ⅱ类分子介导的宿主排斥，同时过表达HLA-E、HLA-G或CD47以保护治疗细胞免受宿主NK与巨噬细胞清除；还可引入NKG2A敲除等功能强化修饰。干细胞来源产品可通过单克隆筛选获得遗传背景均一、质量稳定的主细胞库，支持大规模生产与提前储备，真正实现现货供应，解决自体疗法的可及性瓶颈。
体内CAR工程则为彻底简化制备流程提供了可能。巨噬细胞因具备天然吞噬能力且广泛分布于骨髓、肝脏、脾脏等器官，是体内基因修饰的理想靶标。临床前研究已通过脂质纳米颗粒（LNPs）递送质粒或mRNA，成功在体内将巨噬细胞重编程为靶向MUC1、GPC3、CD133的CAR-Ms，并在胰腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤模型中验证了抗肿瘤效力。将其拓展至髓系恶性肿瘤需解决几个关键问题：筛选高度特异的白血病表面靶点、优化递送系统以实现骨髓巨噬细胞优先转导、降低肝脏与肺部等器官的脱靶效应、设计安全开关控制炎症毒性，并明确CAR表达的持久性与长期免疫记忆特征。
生产制造、可扩展性与监管考量
各平台均面临独特的工艺与监管挑战：CAR-NK需根据外周血、脐带血、NK-92、iPSC等不同来源制定差异化的质量标准与效力检测方法；iPSC与HSPC衍生产品需严格评估基因组稳定性、分化保真度、残留未分化细胞风险、插入突变风险及批次一致性；CAR-Ms需建立涵盖CAR依赖靶向、抗原特异性吞噬、炎性极化、细胞因子分泌、抗原提呈与T细胞招募的多维效力评价体系。监管要求也随平台而异：多重编辑iPSC产品需完善身份鉴别、纯度、活力、无菌、效力、核型/基因组稳定性与多能细胞残留检测；HSPC衍生CAR-NKT需标准化分化效率、NKT纯度、CAR表达、同种反应性测试与功能效力；体内CAR工程则需额外关注递送载体的生物分布、脱靶转导、CAR表达持续时间、剂量可控性与炎症毒性管理。只有同步完善化学、制造与控制（CMC）策略，才能支撑这些创新疗法从临床前走向常规临床应用。
