一种时间可控的等温扩增-CRISPR/Cas12a平台，用于快速检测猴痘病毒

《Virology Journal》：A temporally controlled isothermal amplification-CRISPR/Cas12a platform for the rapid detection of monkeypox virus

　　

摘要

背景

鉴于全球新发和再发传染病带来的持续威胁，迫切需要一种快速、灵敏且实用的分子检测技术，以实现及时的即时检测（POC）诊断。尽管基于定量实时PCR（qPCR）的技术在灵敏度和特异性方面优于传统的病原体检测方法，但它们并不适用于POC检测场景。

方法

本研究基于光控原理，通过用光可裂解的保护基团6-硝基哌酮氧甲基（NPOM）修饰LbCas12a crRNA重复区域中的四个位点，建立了一种通用的光激活策略。该策略与多酶等温快速扩增（MIRA）技术相结合，开发出一种用于检测猴痘病毒（MPXV）的光控一步快速检测方法，称为时间控制MIRA-CRISPR/Cas12a（TC-MIRA-CRISPR/Cas12a）检测方法。

结果

TC-MIRA-CRISPR/Cas12a检测方法的检测灵敏度比传统的一步检测方法提高了100倍，检测限（LOD）达到每反应3.9个拷贝，与分步检测方法相当。整个检测过程可在40分钟内完成，比广泛使用的qPCR更快。在临床样本检测中，该方法与qPCR具有良好的一致性，Kappa系数为0.980（P < 0.001），灵敏度为98.4%，特异性为100%。

结论

该方法有效避免了扩增子污染，同时保持了高灵敏度，并表现出优异的通用性和扩展性。只需修改crRNA的间隔序列，即可检测其他病原体，为MPXV及其他病原体的POC检测提供了一种新的技术方法和研究视角。