马恩菲篮状菌(Talaromyces marneffei) SA2a及其紫红玉色素(Purpuride)对植物与人体病原物的拮抗及抗菌活性

《Biotechnology for the Environment》：Antagonistic and antibacterial activities of Talaromyces marneffei SA2a and its purpuride pigment against plant and human pathogens

　　

背景：本研究探讨温度依赖性双相真菌马恩菲篮状菌(Talaromyces marneffei)的生物潜能，其可产生具环境保护、农业、化妆品、食品及医药应用价值的次级代谢产物。鉴于对生防制剂及有效抗微生物剂日益增长的需求，本研究考察马恩菲篮状菌SA2a株及其红色色素对引起木薯块茎腐烂的菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)及病原菌的拮抗与抗微生物活性。方法：马恩菲篮状菌获自微生物保藏培养物并于马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar, PDA)上复苏。采用共培养法评估该真菌对M. phaseolina的拮抗活性。优化真菌红色色素产生条件，用紫外-可见分光光度计(UV-Visible spectrophotometer)鉴定色素。采用琼脂孔扩散法(agar well diffusion method)测定色素粗提物对多重耐药临床细菌分离株的抗微生物活性。结果：该真菌对M. phaseolina表现拮抗活性，生长周边出现抑制带。色素最大吸收波长λmax为512 nm，初步鉴定为Purpuride。最适产色素条件为pH 5.4、25 °C、4%甘油(glycerol)。该色素对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus) ATCC 10876（抑菌圈32 ± 0.50 mm）、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) ATCC 8309（24 ± 0.70 mm）及大肠埃希菌(Escherichia coli) DSM 10974（12 ± 1.41 mm）具抑制作用。结论：马恩菲篮状菌SA2a及其红色色素对M. phaseolina具显著拮抗活性，并对多重耐药细菌具抑制效应。表明该真菌具生物防治潜力，其红色色素可用于应对抗生素耐药性这一全球挑战。

发表于《Biotechnology for the Environment》的本研究，针对木薯毁灭性土传病原菌菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)缺乏安全高效生防制剂，以及临床多重耐药(multidrug-resistant, MDR)细菌感染日益严峻两大现实问题，探究了马恩菲篮状菌(Talaromyces marneffei) SA2a株（GenBank登录号OR387723.1）及其分泌性红色色素对植物病原真菌与医学重要病原菌的拮抗和抗菌活性，旨在发掘其作为农业生防因子及新型天然抗菌物质的潜力。研究人员通过真菌共培养拮抗试验、发酵产色素条件优化、色素稳定性测试、紫外-可见光谱鉴定及琼脂孔扩散法抗菌/抗真菌筛选，证实T. marneffei SA2a可有效抑制M. phaseolina生长，其分泌的红色氮杂蒽酮类(azaphilone)色素Purpuride对革兰阳性与部分革兰阴性MDR病原菌具明显抑制活性，最适产色素条件为弱酸性、25 °C及添加4%甘油。该研究表明T. marneffei具开发为木薯抗根腐病生防菌剂的潜力，其Purpuride色素可作为先导化合物应对细菌耐药性问题。

主要关键技术方法：研究人员选用已鉴定的Talaromyces marneffei strain SA2a及Macrophomina phaseolina strain 3A为供试菌株；以PDA平板共培养法评价真菌对植物病原的拮抗作用并测量抑菌带；Sabouraud dextrose broth(SDB)液体发酵产色素，乙酸乙酯萃取，UV-Vis spectrophotometer于450–700 nm扫描鉴定(λ_max=512 nm)并初定为Purpuride；在不同pH(3–8)、NaCl(0–2.5%)、葡萄糖(0–2.5%)下检测色素稳定性；单因素优化法考察初始培养基pH(3.0–11.0)、温度(20–42 °C)及外加甘油浓度(1–4%)对菌丝生物量干重及色素产量的影响；采用agar well diffusion method检测不同浓度(200–12.5 mg/mL)色素粗品对标准菌株——Bacillus cereus ATCC 10876、Klebsiella pneumoniae ATCC 8309、Escherichia coli DSM 10974、MRSA ATCC 71、Salmonella enteritidis ATCC 1381、Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027及致病真菌Penicillium chrysogenum、Penicillium oxalicum、Aspergillus fumigatus、Aspergillus sydowii——的抑制活性；数据以one-way ANOVA(p<0.05为显著)分析。

研究结果

Identification of fungi

研究人员将复苏培养的T. marneffei SA2a进行形态学与显微镜观察，菌落呈灰绿色，分生孢子梗分支，具间胞(metulae)与瓶梗(phialides)，分生孢子球形，符合Talaromyces属特征，确认菌株身份。

Antagonistic activity of the fungus

研究人员将T. marneffei SA2a与M. phaseolina strain 3A在PDA上共培养，48–120 h持续观察到M. phaseolina菌丝生长受抑，SA2a菌饼周围出现明显透明抑菌带(inhibition zone)，表明该菌株通过分泌次级代谢产物拮抗M. phaseolina，具生防潜力。

Extraction of pigment and Uv-Vis spectrophotometer identification

研究人员在25 °C SDB中培养SA2a 14 d获红色胞外色素，等体积乙酸乙酯萃取。UV-Vis扫描于λ_max=512 nm处有强吸收峰，与文献报道Purpuride(一种azaphilone类红紫色素)吻合，初步鉴定所产红色色素为Purpuride。

Stability of pigment

研究人员测试色素在pH 3–8、NaCl(0–2.5%)、葡萄糖(0–2.5%)下的稳定性。原始色素pH≈4.3；pH 5.0–6.0时吸光度与显色强度略升高，pH 3.0、7.0–8.0时下降；不同浓度NaCl和葡萄糖不改变吸收波长(λ_max不变)，仅部分溶解，说明色素在中性盐糖环境中光吸收稳定，对弱酸至近中性条件耐受较好。

Optimization of growth parameters on fungal cell biomass and intensity of pigment

研究人员系统考察培养参数影响：温度方面，25 °C时菌丝干重与色素OD_{512 nm}最高(分别为84.7±3.06 g/L与最大值)，30 °C下降，37 °C极低且不产色素，42 °C无菌丝生长，确认最适为25 °C；pH方面，pH 5.6时生物量与色素最强(pH 5.4为文中给出最适值)，pH≥9.0显著降低，pH 11.0不生长，确认弱酸性最适；外加碳源方面，随甘油浓度升至4%(w/v)，菌丝干重(达172.7±3.10 g/L)与色素产量同步递增，无甘油对照组最低。ANOVA显示各因素差异显著(p<0.05)。

Antimicrobial activities of crude pigment

研究人员用200–12.5 mg/mL梯度浓度色素做琼脂孔扩散试验：对Bacillus cereus ATCC 10876抑菌圈达32±0.50 mm(最低有效12.5 mg/mL时20±0.70 mm)，对Klebsiella pneumoniae ATCC 8309为24±0.70 mm(MIC≈25 mg/mL, 17±0.70 mm)，对Escherichia coli DSM 10974为12±1.41 mm(MIC≈100 mg/mL, 10±0.70 mm)；对MRSA ATCC 71、Salmonella enteritidis ATCC 1381及Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027无抑制；对Penicillium chrysogenum与Aspergillus fumigatus有轻微短时抑制但受试真菌后期出现耐受。表明Purpuride对部分G⁺及G^?病原菌具浓度依赖性抑菌活性。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，T. marneffei SA2a在PDA上成功复苏并经显微形态验证；共培养中出现的M. phaseolina生长抑制带归因于SA2a产生的色素及其他抗真菌次级代谢物，与Trichoderma等生防真菌作用模式相似，支持其作木薯 tuber腐烂生防剂。红色Purpuride色素在SDB中良好合成并于λ_max=512 nm被初定为azaphilone类Purpuride，与既往T. marneffei SA2a研究及T. purpureogenus产Purpuride报道相符。色素在食盐与糖类环境中吸收峰稳定，pH近中性至微酸较稳。最适产色素条件——初始pH≈5.4、25 °C、4%甘油——可最大化生物量与Purpuride产量。粗色素对B. cereus、K. pneumoniae及E. coli具清晰抑制圈，尤其对G⁺B. cereus效果最强，与文献中azaphilone类及prodigiosin类色素抗菌谱相近。研究局限为未采用标准肉汤微量稀释法(broth microdilution assay)确定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，后续拟补充。

结论：本研究表明马恩菲篮状菌(Talaromyces marneffei) SA2a株对致木薯块茎腐烂的菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)具显著拮抗活性，其分泌的红色Purpuride色素对部分多重耐药病原菌具抑制效应。T. marneffei SA2a有潜力开发为农业生物防治剂以防控M. phaseolina所致作物病害，其Purpuride色素值得进一步研究作为应对抗生素耐药性危机的新型天然抗微生物先导分子。