嗜热解淀粉芽孢杆菌BSP耐热MprT金属蛋白酶在双宿主系统中的异源表达及表征

《International Microbiology》：Heterologous expression and characterization of a thermostable MprT metalloprotease from thermophilic Bacillus subtilis BSP in dual host systems

　　

嗜热细菌是工业应用稳健酶的重要来源，但其较高的生长温度往往限制了大规模培养。本研究从嗜热解淀粉芽孢杆菌BSP中克隆了编码耐热金属蛋白酶的MprT基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)和蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌1A751中进行了异源表达。全长MprT开放阅读框（1638 bp）包括其天然信号肽和前肽序列，通过PCR扩增并插入pET29b载体，在T7启动子控制下于大肠杆菌中表达。随后将同一基因克隆到整合载体pDR111（IPTG诱导型hyper-spank启动子）和pSG1154（木糖诱导型启动子）中，用于在枯草芽孢杆菌1A751中进行染色体整合和胞外分泌。重组构建体通过限制性酶切、桑格测序和SDS-PAGE验证，确认产生了36 kDa的多肽。在含有适当诱导剂的酪蛋白补充琼脂平板上证明了功能性表达，在60°C孵育后出现清晰的水解晕圈。纯化的重组MprT蛋白酶在50°C和pH 7-8时显示出最佳活性，在60°C下30分钟后保留了82%的初始活性，并在宽pH范围（4-11）内保持稳定。Ca2?、Fe2?和Mn2?离子强烈刺激其活性，而EDTA完全消除了其活性，这与将其归类为金属蛋白酶相一致。与先前关于类热溶素蛋白酶的报告相比，本工作首次在蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌宿主中成功实现了BSP来源的MprT基因的功能性过表达，使得能够在中等培养温度下实现高效的胞外生产，同时保留了该酶的天然耐热性和耐碱性。这些特性使重组MprT成为在恶劣工业条件下进行的洗涤剂配方和废物制生物燃料过程的有前景的候选者。

论文解读：耐热MprT金属蛋白酶在双宿主系统中的异源表达与表征

研究背景与意义

嗜热微生物因其在高温环境下进化出的独特酶系，成为工业生物技术中极具价值的资源。这类微生物产生的耐热酶在高温、极端pH值及有机溶剂等苛刻条件下表现出卓越的结构稳定性和催化效率，广泛应用于洗涤剂制造、食品加工、皮革鞣制和生物燃料生产等领域。然而，嗜热菌本身的高生长温度要求（通常在55°C以上）给大规模工业化发酵带来了显著挑战，包括能耗高、设备要求严苛以及潜在的污染风险。因此，将嗜热酶基因转移至易于培养的中温宿主中进行异源表达，是实现其低成本、高效率规模化生产的关键策略。本研究聚焦于一种源自嗜热解淀粉芽孢杆菌BSP的耐热金属蛋白酶MprT，旨在通过双宿主系统解决其原生宿主培养难题，并深入解析该酶的生化特性，为其工业应用奠定基础。该研究成果已发表于《International Microbiology》期刊。

关键技术方法

本研究采用了分子克隆、异源表达、蛋白质纯化与生化表征等核心技术。研究人员首先从嗜热解淀粉芽孢杆菌BSP基因组中PCR扩增获得包含完整信号肽、前肽及成熟区序列的MprT基因（1638 bp）。该基因被分别构建至大肠杆菌表达载体pET29b（由T7启动子驱动）和枯草芽孢杆菌染色体整合载体pDR111（由IPTG诱导的hyper-spank启动子驱动）及pSG1154（由木糖诱导启动子驱动）中。重组质粒经限制性内切酶消化和桑格测序验证后，转化至相应宿主：大肠杆菌BL21(DE3)用于细胞内表达，蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌1A751用于细胞外分泌表达。通过阴离子交换色谱法从大肠杆菌可溶性组分中纯化了重组MprT蛋白酶。最终，采用酪蛋白水解法测定酶活性，系统评估了其最适反应温度与pH值、热稳定性、pH稳定性以及对各类金属离子和抑制剂的响应。

研究结果

基因扩增与克隆

PCR扩增成功获得了预期大小为1638 bp的MprT基因片段。将该片段定向克隆至pET29b载体，并通过酶切和测序验证了重组质粒pET29b-BSP-MprT的正确性。同时，成功构建了用于枯草芽孢杆菌染色体整合的表达盒pDR111-BSP-MprT和pSG1154-BSP-MprT。

序列分析与系统发育定位

克隆的MprT基因序列（GenBank登录号KP792792450）经BLAST比对，与酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）的一种金属蛋白酶基因具有100%的序列同一性。基于邻接法（Neighbor-Joining method）的系统发育分析将MprT明确归类于热溶素（thermolysin）家族金属蛋白酶，并获得高自举值（bootstrap value）支持，证实了其分类学地位。

结构建模

利用ColabFold平台上的AlphaFold2服务器对MprT进行三维结构预测。模型显示出较高的残基水平置信度评分（pLDDT > 85），揭示了典型的类热溶素折叠结构，并包含保守的HE^xxH锌离子结合基序。二级结构分析表明，该酶由35.16%的α-螺旋、25.82%的延伸链、11.36%的β-转角以及27.66%的无规卷曲构成。

在大肠杆菌中的表达与纯化

SDS-PAGE分析证实，重组MprT在大肠杆菌BL21(DE3)中以约36 kDa的可溶性蛋白形式表达。通过HiTrap Q HP阴离子交换层析进行一步纯化，获得了高纯度的酶制剂，纯化倍数与回收率等数据详见表2。

在枯草芽孢杆菌1A751中的表达与胞外分泌

将重组质粒整合至蛋白酶缺陷宿主枯草芽孢杆菌1A751染色体后，在含1%酪蛋白的平板上，经诱导剂和60°C孵育，转化子周围形成了清晰的水解圈，而空载体对照则无此现象，直观证明了功能性胞外分泌。定量分析显示，携带pDR111-BSP-MprT的菌株（受hyper-spank启动子驱动）比携带pSG1154-BSP-MprT的菌株（受木糖启动子驱动）产生更高的胞外蛋白酶活性，因此被选用于后续研究。SDS-PAGE进一步在诱导后的培养上清中检测到特异的36 kDa条带。

重组MprT蛋白酶的生化特性

纯化的重组酶最适反应温度为50°C，最适pH范围为7-8。该酶在60°C预处理30分钟后仍能保留82%的初始活性，表现出良好的中等程度耐热性。其pH稳定性范围宽广（pH 4-11）。金属离子效应研究显示，Ca2?、Fe2?和Mn2?能显著激活其活性（相对活性分别达122%、113%和104%），而Cu2?则表现出强抑制作用（残留活性22%）。EDTA作为金属螯合剂，能完全抑制其活性，确证了其为依赖金属离子的蛋白酶。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和还原剂β-巯基乙醇、DTT对其有部分抑制作用，提示二硫键可能参与维持其活性构象。

讨论与结论

本研究成功克服了嗜热酶生产中宿主培养温度高的瓶颈，首次在蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌1A751中实现了BSP来源MprT金属蛋白酶的高效功能性过表达与胞外分泌。相较于大肠杆菌系统，枯草芽孢杆菌系统不仅简化了下游纯化流程，更在中等培养温度（37°C）下保留了该酶优异的天然耐热性和耐碱性。

研究结论明确指出，重组MprT蛋白酶在50°C和pH 7-8条件下表现出最佳活性，在60°C处理30分钟后仍保持82%的活性，并具有宽泛的pH稳定性。其活性受到Ca2?、Fe2?和Mn2?的强烈促进，并被EDTA完全消除。这些特性，结合其在枯草芽孢杆菌中高效的分泌表达能力，使得重组MprT成为洗涤剂配方和蛋白质废物水解制备生物燃料等工业过程的理想候选酶制剂。此项工作为耐热蛋白酶的工业化生产与应用提供了一个高效、可行的技术平台。