褪黑素调控鸣禽鸣唱控制神经元夜间神经活动及听觉处理的昼夜节律变化

《Journal of Comparative Physiology A》：Nightly changes in neural activity and auditory processing of song control neurons depend on melatonin

　　

鸟类鸣唱与许多复杂行为模式一样，需要在生命周期中不断习得、维持和调整。在鸣禽中，这些功能由一个特化的神经网络——鸣唱控制系统（song control system）执行。夜间睡眠已被证明对鸣唱学习和维持过程至关重要。在表达褪黑素受体的多个鸣唱控制脑区中，可观察到显著的昼夜神经活动变化，这些受体频繁表达于抑制性中间神经元。研究人员通过将褪黑素效应与睡眠的混杂效应相分离，同时连续监测自由活动的成年雄性斑胸草雀鸣唱控制系统中单个神经元的活动达数日，揭示了褪黑素对鸣唱控制神经元自发放电活动以及听觉诱发放电活动的直接作用。因此，研究人员提出褪黑素是一种内分泌开关，能够激活鸣唱控制神经元的夜间神经功能，这对鸣唱运动记忆（song motor memory）的形成和巩固至关重要。

## 研究背景与问题

睡眠作为一种生理状态，在动物界中普遍存在。在人类中，睡眠对心理健康、记忆巩固和技能表现具有重要意义。睡眠期间的脑活动与清醒状态存在诸多差异，功能性磁共振成像研究显示夜间特定脑区的活动增加与睡眠纺锤波和慢波相关，而睡眠期间的神经活动对记忆形成和巩固至关重要。鸟类鸣唱是一个研究睡眠与记忆关系的经典模型：在鸣禽特定脑区，与鸣唱产生相关的神经活动在夜间自发出现，对鸣唱学习和维持似乎至关重要。睡眠剥夺及其导致的神经重放缺失对幼鸟鸣唱学习有严重影响。在成年鸟类中，向睡眠中的动物播放其自身鸣唱（bird's own song, BOS）可诱发与夜间自发活动相似的神经模式，而这种反应在白天清醒状态下不会出现。这种夜间神经再激活被认为影响记忆形成甚至改变现有记忆，但其确切生物学功能尚不完全清楚，可能与纠正白天鸣唱中积累的小幅表现变化、从而维持鸣唱运动记忆有关。

鸣唱控制脑区中夜间重放样活动以及对BOS播放的状态依赖性敏感提示可能存在一种昼夜节律性的内源性因子，将鸣唱控制系统从日间模式切换至夜间模式。褪黑素可能是这样一种因子：其在包括鸣唱产生通路关键脑区在内的多个脑区广泛表达受体。褪黑素是鸟类主要由松果体分泌的激素，夜间浓度高、白天浓度低，且其丰度与光/暗周期的暗期密切相关。然而，褪黑素是否直接调控鸣唱控制神经元的活动，以及这种调控是否独立于睡眠状态，此前尚未被直接证实。因此，本研究旨在解析褪黑素对鸣唱控制神经元活动的直接效应，并将其与睡眠的效应相区分。

## 关键技术与方法

本研究采用无线轻量遥测装置对自由活动斑胸草雀进行连续多日的神经元活动监测；运用褪黑素乳膏皮肤涂抹法模拟自然夜间褪黑素水平及其昼夜波动；通过胞外记录技术记录弓狎核（nucleus robustus arcopallialis, RA）投射神经元和Field L区神经元活动；采用鸟自身鸣唱（BOS）播放作为听觉刺激评估神经元听觉反应性；运用RNAScope荧光多重原位杂交技术定位褪黑素受体表达细胞类型；使用峰检测和K均值聚类算法进行单单位神经信号分离，受限最大似然法（REML）结合Tukey事后检验进行统计分析。

## 研究结果

### 褪黑素对鸣叫活动的影响

研究人员比较了所有鸟类在白天、正常夜间以及褪黑素处理后的三小时窗口期内的鸣叫活动。结果显示，褪黑素处理后鸟类并未停止鸣叫活动，其在恒定光照条件下模拟自然夜间褪黑素水平的处理并未诱导睡眠。这表明所用褪黑素处理方案不会使鸟类镇静或入睡，从而可以将褪黑素的效应与睡眠的效应相分离。

### RA神经元活动模式呈现昼夜变化

通过对成年雄性斑胸草雀RA神经元进行多日连续胞外记录，研究人员发现RA投射神经元除在主动鸣唱时表现出高度刻板化的爆发模式外，还具有特征性的规则基线活动。同一记录单元可在单个个体中维持21至71小时的连续记录，总记录时长达430小时。追踪峰间隔（inter-spike interval, ISI）长度发现，白天ISI较短（40.57±8.02 ms），夜间ISI显著延长（53±11.95 ms），表明存在显著的昼夜活动模式差异。

### 褪黑素而非睡眠触发RA神经元基线活动变化

为精确确定褪黑素的效应，研究人员将鸟类置于恒定光照条件（LL，使血浆褪黑素水平降至基线），随后施以褪黑素处理，同时监测行为和神经活动。结果显示，在清醒的鸟类中，褪黑素处理后ISI可靠地变长（平均46.71±8.08 ms），与正常白天相比显著延长，且与夜间睡眠时的ISI无显著差异。统计分析证实夜间神经元ISI以及褪黑素处理后白天的ISI均显著长于白天基线水平（REML, 处理因素：F_2,48=94.43, P<0.0001）。这一发现表明，升高的褪黑素水平可在清醒动物中引发与夜间睡眠相似的神经放电活动整体变化，提示褪黑素是触发睡眠动物这些变化的关键因素。此外，熄灯后和褪黑素处理后基线放电率变化及ISI增加的时间进程也具有可比性。

### RA神经元对听觉刺激的反应性依赖于褪黑素

在确立褪黑素参与RA基线放电昼夜变化后，研究人员进一步考察了与鸣唱相关的神经活动。BOS播放已知可在清醒幼年和睡眠或麻醉成年斑胸草雀中诱发RA投射神经元基线活动模式的改变，产生与鸣唱爆发相似的刻板化模式。通过在实验全过程中进行BOS播放，包括自然昼夜转换以及处理诱导褪黑素水平变化的阶段，研究人员追踪了RA神经元对BOS反应性的变化。结果显示，夜间BOS播放可靠地诱发特征性神经活动模式，与正常鸣唱产生时的爆发精确锁定于各音节；在褪黑素处理的清醒鸟类中同样观察到这种反应模式（n=6只）；而白天未处理的清醒鸟类对BOS播放无显著反应（n=6只）。统计分析证实夜间正常睡眠条件以及褪黑素处理后清醒条件下的BOS播放均导致显著增加的放电计数（REML, 处理因素：F_2,198=8.83, P=0.0002）。此外，夜间和褪黑素处理后BOS敏感性的出现与ISI增加相对应。

为排除褪黑素通过全脑系统性效应而非特定鸣唱相关核团中褪黑素受体表达导致神经活动变化的可能性，研究人员在两只雄性斑胸草雀的Field L（初级听觉皮层样区域，不表达褪黑素受体）进行了对照记录。结果显示，Field L单个神经元在所有测试条件下对随机BOS播放均表现出显著反应，但熄灯或褪黑素处理均未引起基线放电活动或对BOS反应性的显著变化，表明褪黑素的效应具有靶点特异性。

### RA中表达褪黑素受体mRNA的神经元

RNAScope原位杂交结果显示，在表达褪黑素受体1B（MNTR1B）mRNA的RA神经元中，24.1±5.2%共表达谷氨酸脱羧酶（GAD）mRNA，75.9±8.3%共表达囊泡谷氨酸转运体SLC17A6 mRNA；在GAD标记细胞中，31.8±6.7%共表达MNTR1B mRNA；在SLC17A6阳性细胞中，44.9±7.1%为MNTR1B阳性。这表明褪黑素受体在RA的γ-氨基丁酸能中间神经元和谷氨酸能投射神经元中均有相当比例的表达。

## 讨论与结论

### 讨论部分总结

研究人员在讨论部分深入分析了褪黑素作为鸣唱控制系统昼夜转换开关的机制意义。RA区表达褪黑素受体的特定神经元群体中，白天施用褪黑素可激活仅在夜间睡眠鸟类中观察到的神经活动模式。通过分离褪黑素效应与睡眠整体效应，研究证实睡眠鸟类中观察到的RA神经元规则基线放电减慢实际上与褪黑素的存在偶联。此外，RA神经元对听觉刺激（特别是BOS）的敏感性与褪黑素依赖的内在放电活动变化相关，独立于一天中的具体时间。

关于听觉诱发活动的神经机制，研究人员指出夜间RA神经元对BOS的专属敏感性此前已有报道，而褪黑素作为暗信号的内源性释放具有进化保守性。与睡眠作为一种行为状态类似，褪黑素的夜间释放帮助大脑规律性地调节昼夜节律。在清醒时，感觉信息被主动收集和验证；而睡眠期间，对外部世界的感知很大程度上被阻断。丘脑作为前脑的感觉门控结构，被认为在睡眠期间阻止大多数感觉信号传递至皮层和皮层样区域。然而，褪黑素等睡眠或夜间相关因子可能直接影响皮层和皮层样区域的感觉处理，这在鸟类中尤为重要，因为褪黑素受体在包括RA神经元在内的禽类大脑中广泛高表达。

研究人员进一步推测褪黑素调控RA神经元的具体回路机制：由于褪黑素受体表达于RA中间神经元和谷氨酸能投射神经元，褪黑素可能影响听觉输入和运动输出活动。夜间自发RA活动与睡眠鸟类鸣管肌肉活动相关。褪黑素依赖的听觉门控可能通过改变抑制性神经元活动实现，这些神经元允许来自Field L或HVC的听觉输入。由于HVC也表达褪黑素受体，褪黑素引起的BOS听觉门控可能始于HVC而非RA本身。

值得注意的是，此前自发神经重放和对BOS播放的神经反应在白天及夜间觉醒时均不出现，因此睡眠被认为对这些神经模式的出现至关重要。本研究结果则显示，RA神经元在褪黑素存在时可靠地对BOS产生反应，独立于白天时间或觉醒状态。此外，入睡后ISI增加和对BOS播放反应性的出现并非立即发生，而是有约30分钟的延迟，这与熄灯后血液中褪黑素浓度升高所需时间或白天褪黑素处理后浓度升高时间相对应。研究人员还讨论了去甲肾上腺素（NE）与褪黑素的相互作用：夜间突然觉醒被认为由NE释放触发，而HVC和RA接受强儿茶酚胺能输入，NE释放可能通过覆盖褪黑素效应使系统暂时切换回典型日间活动模式。

### 研究结论

本研究结论指出，褪黑素是调节鸣唱控制系统神经活动昼夜变化的关键因子。通过门控RA神经元内在基线神经活动的变化并影响其听觉兴奋性，褪黑素使鸣唱控制系统从白天的主动鸣唱产生和对感觉输入缺乏反应性，切换至夜间的听觉信息处理和内源性神经重放。鉴于褪黑素受体在哺乳动物皮层区域和海马中也广泛表达，褪黑素敏感机制可能直接参与多种依赖夜间重放进行形成、巩固和维持的技能。在鸟类中，光污染对夜间褪黑素产生的干扰可能不仅对发声交流（本研究；Wang等2012；Deregnaucourt等2012；Jansen等2005）而且对多种脑功能和行为产生严重影响（Helm等2024；Buniyaadi等2022；Moaraf等2025）。